酵母毒性およびサプレッサースクリーンを用いた細菌エフェクタータンパク質を標的とする宿主経路の同定

ここで提示されたものと同様の手順の最初のレポートは、レジオネラ肺炎球菌型IVエフェクターSidD、Rab1^1を変質するdeAMPylasを特徴としました。同等の技術は、いくつかのL.肺炎球菌エフェク^{ター1、2、3}の特性評価に使用された。アッセイは、コキシエラ・ブルネチーIVエフェクタータンパク^質4を特徴付けるために適応され、最近、クラミジア・トラコマティス含有膜タンパク質の特性評価のためにこの技術の有用性が拡張^された5.

このプロトコルは、2つの主要な部分に分けることができる:1)目的の細菌エフェクタータンパク質が酵母およびクローンで発現され、成長欠陥によって示される有毒な表現型についてスクリーニングされ、2)酵母サプレッサースクリーン、有毒株中の酵母ゲノムライブラリーの発現により毒性表現型が抑制されるものである。したがって、毒性スクリーンは、目的の細菌エフェクターが過剰発現されたときに増殖欠陥として現れる毒性表現型の画面である。細菌エフェクターで正常に変換され、発現する有毒クローンが選択され、次のステップのために保存されます。第2の主要なステップは、有毒酵母クローン内の部分的に消化された酵母ゲノムライブラリーを過剰発現することを含む。このプロトコルで使用するために提案された酵母ゲノムライブラリを構成するプラスミドは5−20 kbのインサートを運び、通常はすべてのプラスミドにわたって〜1.5kbの平均遺伝子サイズの3−13酵母オープンリーディングフレーム(ORF)に対応し、全酵母ゲノムカバーを表す約10倍。アッセイのこの部分は、細菌エフェクタータンパク質の毒性を抑制することを目的とするように、サプレッサースクリーンと呼ばれる。潜在的なサプレッサープラスミドは、酵母から単離され、配列化され、および同定された抑制ORFである。サプレッサースクリーンの根底にある根拠は、エフェクタータンパク質が標的とする宿主経路の成分に結合し、相互作用し、および/または圧倒される成分を、それらの宿主タンパク質を過剰に戻すことができ、経路に対する毒性効果を救うことができるということです。成長欠陥。したがって、毒性を抑制するORFを同定すると、多くの場合、宿主経路の複数の参加者を表す。次に、直交実験を行い、細菌エフェクターが実際に関連経路と相互作用することを検証します。これは、これらのタンパク質が多数の宿主プロセスに関与しているため、クラトリンやアクチンなどの結合パートナーが同定された場合に特に必要です。さらなる実験は、感染中にエフェクタータンパク質の生理機能を解明することができる。毒性およびサプレッサースクリーンはまた、免疫沈降によって検出するのに十分な親和性を有する宿主タンパク質を物理的に結合しない細菌エフェクタータンパク質の生理機能を解読するための強力なツールであり、酵母2ハイブリッドスクリーンでは検出されない可能性のある酵素的ヒットアンドラン相互作用のホスト。

サプレッサースクリーンは、細菌エフェクタータンパク質と宿主経路との間の潜在的な生理学的相互作用を明らかにする強力な方法であり得るが、細菌エフェクタータンパク質は酵母の増殖欠陥を誘導しなければならない。サプレッサー画面はほとんど役に立ちません。さらに、有毒な表現型は、少なくとも2−3_ログ10の成長の欠損をもたらすか、またはサプレッサーを同定することが困難であろう。細胞培養のために実験室が設置されている場合、HeLaなどの一般的な細胞株における毒性のスクリーニングエフェクタータンパク質は、酵母毒性スクリーンを進める努力に値するかどうかについての洞察を与えることができる。HeLa細胞におけるエフェクタータンパク質の湿疹発現は、これらの^{スクリーン4}に用いられる酵母株における毒性と非常に強く相関する毒性をもたらす場合がある。HeLa細胞におけるストレスの観察可能な特徴は、ストレス繊維の喪失、プレートからの細胞剥離、およびアポトーシスを示す核縮合を含む。HeLa細胞におけるストレスの視覚的な徴候は、酵母の増殖欠陥を誘導するための良い候補となるタンパク質を作り、これははるかに迅速に複製し、したがって、本質的な経路の摂動に対してより応答性が高くなります。

サプレッサー画面は、必ずしもホスト・バインディング・パートナーをサプレッサーとして識別するとは限りませんが、ターゲットとするホスト経路の重要なコンポーネントに影響を与える可能性があり、それによってハイジャックされる生物学的プロセスの全体像が得られます。細菌エフェクタータンパク質。表面上、エフェクタータンパク質の結合パートナーを過剰に提供することは、成長欠陥を救出することが期待されるため、これは直感的ではないようです。感染5時に少なくとも10種類のRab GTPアーゼに結合するC.トラコマティスエフェクタープロテインCT229(CpoS)の標的となる経路を同定する取り組みにおいて、Rab結合パートナーのいずれもCT229の毒性を抑制しなかった。しかし、クラトリン被覆小胞(CCV)の密売に関与する多数のサプレッサーが同定され、CT229がRab依存型CCVの密売を特異的に転覆していることを示すさらなる作業につながった。同様に、酵母増殖欠陥を救出したC.ブルネティエフェクタープロテインCbu0041(CirA)を調べたところ、その後、RhoA4に対するGTPアーゼ活性化タンパク質(GAP)としてCirAが機能することが判明した。

細菌エフェクタータンパク質を標的とする宿主経路を解明するための酵母サプレッサースクリーンの有用性はいくら強調してもしすぎることはできず、細胞内細菌エフェクタータンパク質を特徴付けようとする他の研究者は、大きな利益を得ることができます。これらの技術。これらのアッセイは、免疫沈降および/または酵母2つのハイブリッドスクリーンが結合パートナーを見つけることができず、どの経路が細菌エフェクタータンパク質によって標的にされているかを解明できる場合に価値があります。ここでは、細胞内細菌エフェクタータンパク質を標的とする宿主生物学的経路を同定するための毒性およびサプレッサースクリーンの詳細なプロトコルと、これらのアッセイを使用する際に経験した一般的な障害のいくつかおよび対応するソリューション。