このプロトコルの目的は、温度を使用して3次元活性流体の流速を制御することです。この方法の利点は、その時点での流速を調整できるだけでなく、定期的に流量速度を上下にチューニングするなどの動的制御も可能にします。
温度を用いてキネシン駆動の微小管系3次元(3D)活性流体の流速を調整する方法を提示する。この方法は異なった望ましい速度に達するために新しいサンプルを製造する必要性なしで座って速度を調整することを可能にする。さらに、この方法は速度の動的制御を可能にする。温度をサイクリングすると、液体は速く、ゆっくりと、定期的に流れます。この制御性は、キネシン微小管反応のアレニウス特性に基づいており、4~8μm/sの制御された平均流量速度範囲を示します。提示された方法は、チャネルの流量がバルブを必要とせずに局所的に調整できないマイクロ流体デバイスの設計への扉を開きます。
活物質は、化学エネルギーを機械的な作業に変換する能力により、従来の受動物質と区別されます。このような能力を有する材料は、細菌、昆虫、コロイド、穀物、および細胞骨格フィラメント1、2、3、4、5、6、7、8、9、10などの生きているまたは非生きている実体から成ることができる。これらのマテリアル エンティティは、隣接するエンティティと対話します。より大きなスケールでは、乱流のような渦(アクティブ乱流)または材料流れが11、12、13、14、15、16、17、18、19、20のいずれかに自己組織化する。活性物質の自己組織化を理解することは、分子シャトル、光学デバイス、および並列計算21、22、23における様々な応用につながっている。アプリケーションを次のレベルに引き上げるには、自己組織化を超えた制御が必要です。例えば、Palacciららは、手動で制御された青色光にさらされたときにのみ自走するヘマタイト封入コロイドを開発し、生きている結晶24の出現につながった。Morin et al. は、調整不可能な外部電界を用いて圧延キンケコロイドの制御を確立し、その結果、競馬場状のチャネル25にコロイド群れが生じる。これらの以前の作品は、アプリケーションにおけるローカル制御の役割を示し、アクティブな物質のナレッジベースを進めます。
この記事では、キネシン駆動、微小管(MT)ベースの3D活性流体の制御性に焦点を当てます。流体は、MT、キネシン分子モーター、および枯渇剤の3つの主要成分で構成されています。枯渇剤は、後でモータクラスタによってブリッジされるMTをバンドルするために枯渇力を誘発します。これらのモーターはプラス端に向かってMTsに沿って歩く。一対の橋渡しされたMTsisアンチパラレルの場合、対応するモータは反対方向に歩きます。ただし、モータはクラスタ内にバインドされ、離れて歩くことができないため、一対の M (インターフィラメントスライド、図 1A)を協調的にスライドさせます。これらの摺動ダイナミクスが蓄積し、座屈不安定点とブレーク(伸張バンドル、図1B)26に達するまで拡張するMTstoの束を引き起こす。壊れたバンドルは、その後再び伸びる枯渇力によってアニールされ、ダイナミクスが繰り返されます。繰り返しダイナミクスの過程で、バンドルの動きは近くの液体をかき混ぜ、ミクロンスケールトレーサーでドーピングすることによって可視化できる流れを誘導する(図1C)。Sanchez et al. および Henkin et al. はトレーサーの平均速度を特徴付けており、アデノシン三リン酸(ATP)、枯渇剤、運動クラスター、および MTs19,27の濃度を変化させることによって速度が調整可能であったことを発見した。しかしながら、このようなタンビリティは活性流体合成の前にのみ存在していた。合成後、タンビリティが失われ、流体は独自の方法で自己組織化されました。合成後の活性流体活性を制御するために、Ross.etal.は、運動タンパク質の光活性化二量体化を用いた方法を報告し、光28を用いて流体活性をオン/オフすることを可能にする。光制御は、流体を局所的に活性化するという点で便利ですが、この方法では、顕微鏡で光路を修正するとともに、運動タンパク質の構造を再設計する必要があります。ここでは、モータ構造をそのまま維持しながら、顕微鏡の改造を行わずに流体の流れを局所的に制御するための使いやすい方法を提供します。
キネシン-MT反応は温度29、30、31、32で増加することが報告されているので、局所的に活性流体の流れを調整する私たちの方法は、アレニウス法に基づいています。これまでの研究では、活性流体流れの平均速度の温度依存性がアレニウス方程式に従ったことを示した: v = exp(-Ea/RT)、Aは前指数因子、Rはガス定数、Eは活性化エネルギー、Tはシステム温度33である。 従って、流体活性は温度環境に敏感であり、かつシステム温度がモータ性能を安定させるために一貫している必要があり、その結果、流体流量速度34。この記事では、モータの温度依存性を使用して、システム温度を調整してアクティブ流体の流速を連続的に調整する方法を示します。また、活性流体サンプルの調製をデモンストレーションし、次にコンピュータソフトウェアを介して温度を制御する顕微鏡ステージにサンプルを取り付けます。温度を16°Cから36°Cに上げると、平均流量速度が4μm/sに速くなり、さらに、タンビリティは可逆的です:温度を繰り返し増減すると、流れを順次加速および減速します。実証された方法は、MT滑空アッセイ29、30、31、32などのアレニウス法に主な反応が従う広範なシステムに適用可能である。
その場所でアクティブな物質を制御することは、アクティブマター4、5、24、28、54の指向的な自己組織化への扉を開きます。本稿では、システム29、30、31のアレニウス特性に基づいて、温度を使用し?…
The authors have nothing to disclose.
プラスミドK401-BCCP-H6はズヴォニミール・ドギック博士からの贈り物でした。この研究は、ウースター工科大学のクンタ・ウー博士のスタートアップファンドによって支援されました。我々は、ツボニミール・ドギッチ博士がチューブリンを浄化し、ラベルを付け、活性流体を合成するプロトコルに感謝する。マルク・リディラ博士のタンパク質発現と精製に関する専門知識に感謝しています。ウィリアム・ベンジャミン・ロジャー博士は、温度管理されたステージの構築を支援してくださったようお礼を申し上げます。我々は、生物学的材料施設(BMF)の使用のためのブランダイスMRSEC(NSF-MRSEC-1420382)を認めます。我々は、ソフトマター33にBateらからの数字を適応するための化学の王立協会を認める.
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid | Sigma-Aldrich | 238813 | Trolox |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC216550050 | |
3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603 | HACH | 2074038 | Water tubes |
31.75 mm diameter uncoated, sapphire window | Edmund Optics | 43-637 | Sapphire disc |
3M 1181 Copper Tape – 1/2 IN Width X 18 YD Length – 2.6 MIL Total Thickness – 27551 | R.S. HUGHES | 054007-27551 | Copper tape |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1402-1 | |
Adenosine 5'-triphosphate dipotassium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8937 | ATP |
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific | A20006 | Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.) |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Sigma-Aldrich | UFC801024 | Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa |
Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals | Fisher Scientific | ICN802829 | APS |
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1760 | Ampicillin |
Antivibration Table | Nikon | 63-7590S | |
Avanti J-E Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics | VWR | 90000-760 | Agar |
Biotin | Alfa Aesar | A14207 | |
Bucket-plastic white – 2 gallon | Bon | 84-715 | Water bucket |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 746495 | CaCl2 |
Catalase from bovine liver | Sigma-Aldrich | C40 | |
CFI Plan Apo Lambda 4x Obj | Nikon | MRD00045 | 4x air objective |
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift | Nikon | 96372 | GFP filter cube |
CH-109-1.4-1.5 | TE Technology | CH-109-1.4-1.5 | Thermoelectric Cooler (TEC) |
Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics | Fisher Scientific | C0378 | |
Cooling block | N/A | N/A | Custom milled aluminum |
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400 | Bio-Rad | 1610400 | Triphenylmethane dye |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | D128 | DMSO |
DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC165680050 | DTT |
DOWSIL 340 Heat Sink Compound | Dow | 1446622 | Thermal paste |
ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE | Pharmco by Greenfield Global | 111000200CB05 | Ethanol |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E3889 | EGTA |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 798681 | EDTA |
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone | Fisher Scientific | BP1421 | Tryptone |
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 | Yeast extract |
Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 µm | Polysciences | 18861 | Tracer particles |
Glucose Oxidase from Aspergillus niger | Sigma-Aldrich | G2133 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
GpCpp | Jena Bioscience | NU-405L | Guanosine-5′[(α,β)-methyleno]triphosphate (GMPCPP) |
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater | Amazon | B07428NBCW | Copper wire |
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
Hellmanex III | Sigma-Aldrich | Z805939 | Detergent |
HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP410 | NaHEPES |
High performance blender machine | AIMORES | AS-UP1250 | Blender |
His GraviTrap | GE Healthcare | 11003399 | Gravity Column |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside |
Isopropyl Alcohol 99% | Pharmco by Greenfield Global | 231000099 | Isopropanol |
JA-10 rotor | Beckman Coulter | 369687 | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Sigma-Aldrich | G1501 | K-Glutamate |
Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | L6876 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | MgCl2•6H2O |
MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M5057 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt |
MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid |
MP-3022 | TE Technology | MP-3022 | Thermocouple |
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC138450500 | TEMED |
Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | E112352 | Spectrometer |
Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope | Nikon | MEA54000 | |
Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA81 | UV glue |
Novex Sharp Pre-stained Protein Standard | Thermo Fisher Scientific | LC5800 | Protein standard ladder |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well | Thermo Fisher Scientific | NP0335BOX | SDS gel |
Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 365672 | |
Parafilm PM996 Wrap , 4" Wide; 125 Ft/Roll | Cole-Parmer | EW-06720-40 | Wax film |
Pe 300 ultra Illumination System Single Band , 3mm Light Guide control Pod power supply |
Nikon | PE-300-UT-L-SB-40 | Cool LED Illuminator |
Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 78830 | PMSF |
Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99% | BeanTown Chemical | 129745 | PEP |
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23200 | |
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets | Thermo Fisher Scientific | A32953 | |
PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
Poly(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 81300 | PEG. Average molecular weight 20,000 Da |
Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | P250-500 | KOH |
PowerEase 300W Power Supply (115 VAC) | ThermoFisher Scientific | PS0300 | DC power supply of the gel box |
PS-12-8.4A | TE Technology | PS-12-8.4A | DC power supply of the temperature controller |
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma-Aldrich | P-0294 | PK/LDH |
Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour | Amazon | B005JWA612 | Fish tank pump |
Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells – Novagen | Millipore Sigma | 71403 | Competent cells |
Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel | Amazon | B01MT6JZMR | Microwave for boiling the water |
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | S271-500 | NaCl |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | SDS |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S8282 | NaH2PO4 |
Streptavidin Protein | Thermo Fisher Scientific | 21122 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
TC-720 | TE Technology | TC-720 | Temperature controller |
Tris Base, Molecular Biology Grade – CAS 77-86-1 – Calbiochem | Sigma-Aldrich | 648310 | Tris-HCL |
Type 45 Ti rotor | Beckman Coulter | 339160 | |
Type 70 Ti rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
Type 70.1 Ti rotor | Beckman Coulter | 342184 | |
VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-916 | Paper tapes |
VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 | VWR | 48366-227 | Glass coverslips |
VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium | VWR | 75799-268 | Glass slides |
XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher Scientific | EI0001 | Gel box |
ZYLA 5.5 USB3.0 Camera | Nikon | ZYLA5.5-USB3 | Monochrome CCD camera |