El objetivo de este protocolo es utilizar la temperatura para controlar las velocidades de flujo de los fluidos activos tridimensionales. La ventaja de este método no sólo permite regular las velocidades de flujo in situ, sino que también permite un control dinámico, como ajustar periódicamente las velocidades de flujo hacia arriba y hacia abajo.
Presentamos un método para usar la temperatura para ajustar las velocidades de flujo de fluidos activos tridimensionales tridimensionales (3D) impulsados por la quinesina y basados en microtúbulos. Este método permite ajustar las velocidades in situ sin necesidad de fabricar nuevas muestras para alcanzar las diferentes velocidades deseadas. Además, este método permite el control dinámico de la velocidad. Ciclismo la temperatura lleva a los fluidos a fluir rápido y lento, periódicamente. Esta controlabilidad se basa en la característica de Arrhenius de la reacción de kinesina-microtúbulo, lo que demuestra un rango de velocidad de flujo medio controlado de 4-8 m/s. El método presentado abrirá la puerta al diseño de dispositivos microfluídicos donde los caudales en el canal son ajustables localmente sin necesidad de una válvula.
La materia activa se diferencia de la materia pasiva convencional debido a su capacidad para convertir la energía química en trabajo mecánico. Un material que posee tal capacidad puede consistir en entidades vivas o no vivientes como bacterias, insectos, coloides, granos y filamentos citoesqueléticos1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Estas entidades materiales interactúan con sus vecinos. A mayor escala, se autoorganizan en vórtices turbulentos (turbulencia activa) o flujos materiales11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. La comprensión de la autoorganización de la materia activa ha dado lugar a diversas aplicaciones en transbordadores moleculares, dispositivos ópticos y cómputo paralelo21,22,23. Para llevar las aplicaciones al siguiente nivel se requiere control más allá de la autoorganización. Por ejemplo, Palacci y otros desarrollaron un coloide encapsulado de hematita que sólo se autopropulsado cuando se expone a la luz azul controlada manualmente, lo que llevó a la aparición de cristales vivos24. Morin y otros establecieron el control de la rodadura de los coloides de Quincke mediante el uso de un campo eléctrico externo ajustable, lo que resulta en bandadas coloidales en un canal25similar a una pista de carreras. Estos trabajos anteriores demuestran el papel del control local en las aplicaciones y avanzan en la base de conocimientos de la materia activa.
En este artículo, nos centramos en la controlabilidad de fluidos activos 3D basados en microtúbulos (MT) basados en kinesina. Los fluidos consisten en tres componentes principales: MTs, motores moleculares de kinesina y deplorantes. Los depilantes inducen una fuerza de agotamiento para agrupar los MT, que luego son puenteados por los racimos de motor. Estos motores caminan a lo largo del MTstoward el extremo más. Cuando un par de MTsis puenteados son antiparalelos, los motores correspondientes caminan en direcciones opuestas. Sin embargo, los motores están unidos en un racimo y son incapaces de separarse, por lo que se deslizan de forma cooperativa pares de M (deslizamiento entre filamentos, Figura 1A). Estas dinámicas deslizantes se acumulan, haciendo que los haces de MTsto se extiendan hasta alcanzar su punto de inestabilidad de pandeo y rotura (agrupaciones extensivas, Figura 1B)26. Los haces rotos son recocidos por la fuerza de agotamiento, que posteriormente se extiende de nuevo, y la dinámica se repite. Durante el proceso de la dinámica de repetición, los movimientos del haz agitan el líquido cercano, induciendo los flujos que se pueden visualizar mediante el dopaje con trazadores a escala de micrones(Figura 1C). Sánchez y Henkin et al. han caracterizado las velocidades medias de los trazadores, encontrando que las velocidades eran ajustables variando las concentraciones de trifosfato de adenosina (ATP), depilantes, racimos de motores y MTs19,27. Sin embargo, tal atún existía sólo antes de la síntesis de fluido activo. Después de la síntesis, la incapacidad se perdió, y los fluidos se autoorganizados a su manera. Para controlar la actividad del fluido activo después de la síntesis, Ross.et al. informó de un método utilizando la dimerización activada por la luz de las proteínas motoras, permitiendo que la actividad del fluido se afina y apague utilizando la luz28. Mientras que el control de la luz es conveniente en términos de activación local de los fluidos, el método requiere rediseñar las estructuras de las proteínas del motor, junto con la modificación de las trayectorias ópticas en un microscopio. Aquí, proporcionamos un método fácil de usar para controlar localmente los flujos de fluidos sin modificación del microscopio mientras mantenemos intacta la estructura del motor.
Nuestro método de ajuste local del flujo de fluido activo se basa en la ley Arrhenius porque se ha informado que la reacción kinesina-MT aumenta con la temperatura29,30,31,32. Nuestros estudios anteriores mostraron que la dependencia de la temperatura de la velocidad media de un flujo de fluido activo siguió la ecuación de Arrhenius: v – A exp(-Ea/RT), donde A es un factor preexponencial, R es la constante de gas, Ea es la energía de activación, y T es la temperatura del sistema33. Por lo tanto, la actividad del fluido es sensible al ambiente de temperatura, y la temperatura del sistema debe ser consistente para estabilizar el rendimiento del motor y, en consecuencia, la velocidad de flujo de fluido34. En este artículo, demostramos el uso de la dependencia de temperatura del motor para ajustar continuamente las velocidades de flujo de los fluidos activos ajustando la temperatura del sistema. También demostramos la preparación de una muestra de fluido activo, seguida de montaje de la muestra en una etapa del microscopio cuya temperatura se controla a través de software informático. El aumento de la temperatura de 16 oC a 36 oC acelera las velocidades medias de flujo de 4 a 8 m/s. Además, la incapacidad es reversible: aumenta y disminuye repetidamente la temperatura acelera y desacelera secuencialmente el flujo. El método demostrado es aplicable a una amplia gama de sistemas donde las reacciones principales obedecen a la ley Arrhenius, como el ensayo de deslizamiento MT29,30,31,32.
El control in situ de la materia activa abre la puerta a la autoorganización dirigida de la materia activa4,5,24,28,54. En este artículo, presentamos un protocolo para el uso de la temperatura para controlar los fluidos activos basados en MT impulsados por cineína in situ, basado en la característica Arrhenius del sistema29,</s…
The authors have nothing to disclose.
Plásmido K401-BCCP-H6 fue un regalo del Dr. Zvonimir Dogic. Esta investigación fue apoyada por el fondo de puesta en marcha del Dr. Kun-Ta Wu en el Instituto Politécnico de Worcester. Agradecemos al Dr. Zvonimir Dogic los protocolos para purificar y etiquetar la tubulina y sintetizar fluidos activos. Agradecemos al Dr. Marc Ridilla su experiencia en la expresión y purificación de proteínas. Agradecemos al Dr. William Benjamin Roger por ayudarnos con la construcción de la etapa de temperatura controlada. Reconocemos a Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) por el uso de la Instalación de Materiales Biológicos (BMF). Reconocemos a la Royal Society of Chemistry por adaptar las figuras de Bate et al. en Soft Matter33.
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid | Sigma-Aldrich | 238813 | Trolox |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC216550050 | |
3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603 | HACH | 2074038 | Water tubes |
31.75 mm diameter uncoated, sapphire window | Edmund Optics | 43-637 | Sapphire disc |
3M 1181 Copper Tape – 1/2 IN Width X 18 YD Length – 2.6 MIL Total Thickness – 27551 | R.S. HUGHES | 054007-27551 | Copper tape |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1402-1 | |
Adenosine 5'-triphosphate dipotassium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8937 | ATP |
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific | A20006 | Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.) |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Sigma-Aldrich | UFC801024 | Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa |
Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals | Fisher Scientific | ICN802829 | APS |
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1760 | Ampicillin |
Antivibration Table | Nikon | 63-7590S | |
Avanti J-E Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics | VWR | 90000-760 | Agar |
Biotin | Alfa Aesar | A14207 | |
Bucket-plastic white – 2 gallon | Bon | 84-715 | Water bucket |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 746495 | CaCl2 |
Catalase from bovine liver | Sigma-Aldrich | C40 | |
CFI Plan Apo Lambda 4x Obj | Nikon | MRD00045 | 4x air objective |
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift | Nikon | 96372 | GFP filter cube |
CH-109-1.4-1.5 | TE Technology | CH-109-1.4-1.5 | Thermoelectric Cooler (TEC) |
Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics | Fisher Scientific | C0378 | |
Cooling block | N/A | N/A | Custom milled aluminum |
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400 | Bio-Rad | 1610400 | Triphenylmethane dye |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | D128 | DMSO |
DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC165680050 | DTT |
DOWSIL 340 Heat Sink Compound | Dow | 1446622 | Thermal paste |
ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE | Pharmco by Greenfield Global | 111000200CB05 | Ethanol |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E3889 | EGTA |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 798681 | EDTA |
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone | Fisher Scientific | BP1421 | Tryptone |
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 | Yeast extract |
Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 µm | Polysciences | 18861 | Tracer particles |
Glucose Oxidase from Aspergillus niger | Sigma-Aldrich | G2133 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
GpCpp | Jena Bioscience | NU-405L | Guanosine-5′[(α,β)-methyleno]triphosphate (GMPCPP) |
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater | Amazon | B07428NBCW | Copper wire |
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
Hellmanex III | Sigma-Aldrich | Z805939 | Detergent |
HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP410 | NaHEPES |
High performance blender machine | AIMORES | AS-UP1250 | Blender |
His GraviTrap | GE Healthcare | 11003399 | Gravity Column |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside |
Isopropyl Alcohol 99% | Pharmco by Greenfield Global | 231000099 | Isopropanol |
JA-10 rotor | Beckman Coulter | 369687 | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Sigma-Aldrich | G1501 | K-Glutamate |
Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | L6876 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | MgCl2•6H2O |
MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M5057 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt |
MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid |
MP-3022 | TE Technology | MP-3022 | Thermocouple |
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC138450500 | TEMED |
Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | E112352 | Spectrometer |
Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope | Nikon | MEA54000 | |
Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA81 | UV glue |
Novex Sharp Pre-stained Protein Standard | Thermo Fisher Scientific | LC5800 | Protein standard ladder |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well | Thermo Fisher Scientific | NP0335BOX | SDS gel |
Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 365672 | |
Parafilm PM996 Wrap , 4" Wide; 125 Ft/Roll | Cole-Parmer | EW-06720-40 | Wax film |
Pe 300 ultra Illumination System Single Band , 3mm Light Guide control Pod power supply |
Nikon | PE-300-UT-L-SB-40 | Cool LED Illuminator |
Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 78830 | PMSF |
Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99% | BeanTown Chemical | 129745 | PEP |
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23200 | |
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets | Thermo Fisher Scientific | A32953 | |
PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
Poly(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 81300 | PEG. Average molecular weight 20,000 Da |
Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | P250-500 | KOH |
PowerEase 300W Power Supply (115 VAC) | ThermoFisher Scientific | PS0300 | DC power supply of the gel box |
PS-12-8.4A | TE Technology | PS-12-8.4A | DC power supply of the temperature controller |
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma-Aldrich | P-0294 | PK/LDH |
Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour | Amazon | B005JWA612 | Fish tank pump |
Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells – Novagen | Millipore Sigma | 71403 | Competent cells |
Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel | Amazon | B01MT6JZMR | Microwave for boiling the water |
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | S271-500 | NaCl |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | SDS |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S8282 | NaH2PO4 |
Streptavidin Protein | Thermo Fisher Scientific | 21122 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
TC-720 | TE Technology | TC-720 | Temperature controller |
Tris Base, Molecular Biology Grade – CAS 77-86-1 – Calbiochem | Sigma-Aldrich | 648310 | Tris-HCL |
Type 45 Ti rotor | Beckman Coulter | 339160 | |
Type 70 Ti rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
Type 70.1 Ti rotor | Beckman Coulter | 342184 | |
VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-916 | Paper tapes |
VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 | VWR | 48366-227 | Glass coverslips |
VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium | VWR | 75799-268 | Glass slides |
XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher Scientific | EI0001 | Gel box |
ZYLA 5.5 USB3.0 Camera | Nikon | ZYLA5.5-USB3 | Monochrome CCD camera |