Le but de ce protocole est d’utiliser la température pour contrôler les vitesses d’écoulement des fluides actifs tridimensionnels. L’avantage de cette méthode permet non seulement de réguler les vitesses de débit in situ, mais permet également un contrôle dynamique, comme le mise au point périodiquement des vitesses de débit de haut en bas.
Nous présentons une méthode pour utiliser la température pour régler les vitesses d’écoulement des fluides actifs tridimensionnels (3D) à base de kinésine. Cette méthode permet de tuning les vitesses in situ sans avoir besoin de fabriquer de nouveaux échantillons pour atteindre différentes vitesses souhaitées. En outre, cette méthode permet le contrôle dynamique de la vitesse. Le cycle de la température conduit les fluides à circuler rapidement et lentement, périodiquement. Cette maniabilité est basée sur la caractéristique Arrhenius de la réaction kinesin-microtubule, démontrant une plage de vitesse moyenne contrôlée de 4 à 8 m/s. La méthode présentée ouvrira la porte à la conception de dispositifs microfluidiques où les débits dans le canal sont localement réglables sans avoir besoin d’une valve.
La matière active est différenciée de la matière passive conventionnelle en raison de sa capacité à convertir l’énergie chimique en travaux mécaniques. Un matériau qui possède une telle capacité peut consister en des entités vivantes ou non vivantes telles que les bactéries, les insectes, les colloïdes, les grains et les filaments cytosquelettiques1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Ces entités matérielles interagissent avec leurs voisins. À plus grande échelle, ils s’auto-organisent en tourbillons turbulents (turbulence active) ou flux matériels11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Une compréhension de l’auto-organisation de la matière active a conduit à diverses applications dans les navettes moléculaires, dispositifs optiques, et le calcul parallèle21,22,23. Pour amener les applications au niveau suivant, il faut contrôler au-delà de l’auto-organisation. Par exemple, Palacci et coll. ont mis au point un colloïd encapsulé par hématite qui n’est automoteur que lorsqu’il est exposé à la lumière bleue contrôlée manuellement, ce qui a mené à l’émergence de cristaux vivants24. Morin et coll. ont établi le contrôle des colloïdes Quincke roulants à l’aide d’un champ électrique externe réglable, ce qui a entraîné un affluement colloïdal dans un canal de course25. Ces travaux antérieurs démontrent le rôle du contrôle local dans les applications et font progresser la base de connaissances de la matière active.
Dans cet article, nous nous concentrons sur la contrôlabilité des fluides actifs 3D à base de microtubule (MT) à base de kinésie. Les fluides se composent de trois composants principaux : les TM, les moteurs moléculaires de kinésie et les appauvrissements. Les appauvrissements induisent une force d’épuisement pour empaqueter les MT, qui sont plus tard comblés par des groupes moteurs. Ces moteurs marchent le long de la MTstoward l’extrémité plus. Lorsqu’une paire de MTsis pontée antiparallèle, les moteurs correspondants marchent dans des directions opposées. Cependant, les moteurs sont liés dans un cluster et sont incapables de marcher à part, de sorte qu’ils glissent en collaboration à part les paires de MTs (glissement interfilament, Figure 1A). Ces dynamiques de glissement s’accumulent, causant des faisceaux de MTsto s’étendre jusqu’à atteindre leur point d’instabilité et de rupture (faisceaux extésiles, Figure 1B)26. Les faisceaux cassés sont annealed par la force d’épuisement, qui s’étend par la suite encore, et la dynamique se répète. Pendant le processus de la dynamique de répétition, les mouvements de faisceau remuer le liquide voisin, induisant des flux qui peuvent être visualisés par le dopage avec des traceurs à l’échelle micron (Figure 1C). Sanchez et coll. et Henkin et coll. ont caractérisé les vitesses moyennes des traceurs, constatant que les vitesses étaient réglables en variant les concentrationsde triphosphate d’adénosine (ATP), d’épuisements, de grappes motrices et de MT1,27. Cependant, une telle tunability n’existait qu’avant la synthèse active des fluides. Après synthèse, l’amaigrabilité a été perdue, et les fluides auto-organisés à leur manière. Pour contrôler l’activité active des fluides après synthèse, Ross.et al. a signalé une méthode utilisant la dimérisation activée par la lumière des protéines motrices, permettant à l’activité des fluides d’être réglée et désactivée à l’aide de la lumière28. Alors que le contrôle de la lumière est pratique en termes d’activation locale des fluides, la méthode nécessite de repenser les structures des protéines motrices, ainsi que de modifier les trajectoires optiques dans un microscope. Ici, nous fournissons une méthode facile à utiliser pour contrôler localement les flux de fluides sans modification de microscope tout en gardant la structure du moteur intacte.
Notre méthode de régler localement le flux de fluide actif est basée sur la loi Arrhenius parce que la réaction kinesin-MT a été rapportée pour augmenter avec la température29,30,31,32. Nos études précédentes ont montré que la dépendance à la température de la vitesse moyenne d’un flux de fluide actif a suivi l’équation D’Arrhenius: v – A exp(-Ea/RT), où A est un facteur pré-exponentiel, R est la constante du gaz, Ea est l’énergie d’activation, et T est la température du système33. Par conséquent, l’activité des fluides est sensible à l’environnement de température, et la température du système doit être cohérente pour stabiliser les performances du moteur, et par conséquent, la vitesse d’écoulement du fluide34. Dans cet article, nous démontrons l’utilisation de la dépendance à la température du moteur pour régler en permanence les vitesses d’écoulement des fluides actifs en ajustant la température du système. Nous démontrons également la préparation d’un échantillon actif de fluide, suivi par le montage de l’échantillon sur une étape de microscope dont la température est commandée par l’intermédiaire du logiciel d’ordinateur. L’augmentation de la température de 16 à 36 oC accélère la vitesse moyenne d’écoulement de 4 à 8 m/s. De plus, l’advisibilité est réversible : augmenter et diminuer à plusieurs reprises la température accélère et ralentit séquentiellement le débit. La méthode démontrée s’applique à un large éventail de systèmes où les principales réactions obéissent à la loi Arrhenius, comme l’assay MT29,30,31,32.
Le contrôle de la matière active in situ ouvre la porte à l’auto-organisation dirigée de la matière active4,5,24,28,54. Dans cet article, nous présentons un protocole pour l’utilisation de la température pour contrôler la kinésine, à base de MT fluides actifs in situ, basé sur la caractéristique Arrhenius du système29,…
The authors have nothing to disclose.
Plasmid K401-BCCP-H6 était un cadeau du Dr Zvonimir Dogic. Cette recherche a été soutenue par le fonds de démarrage du Dr Kun-Ta Wu à l’Institut polytechnique de Worcester. Nous remercions le Dr Zvonimir Dogic pour les protocoles visant à purifier et à étiqueter la tubuline et à synthétiser les fluides actifs. Nous sommes reconnaissants au Dr Marc Ridilla pour son expertise dans l’expression et la purification des protéines. Nous remercions le Dr William Benjamin Roger de nous avoir aidés à construire la scène à température contrôlée. Nous reconnaissons Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) pour l’utilisation de la Facilité des matériaux biologiques (BMF). Nous remercions la Royal Society of Chemistry d’avoir adapté les chiffres de Bate et coll. sur Soft Matter33.
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid | Sigma-Aldrich | 238813 | Trolox |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC216550050 | |
3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603 | HACH | 2074038 | Water tubes |
31.75 mm diameter uncoated, sapphire window | Edmund Optics | 43-637 | Sapphire disc |
3M 1181 Copper Tape – 1/2 IN Width X 18 YD Length – 2.6 MIL Total Thickness – 27551 | R.S. HUGHES | 054007-27551 | Copper tape |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1402-1 | |
Adenosine 5'-triphosphate dipotassium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8937 | ATP |
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific | A20006 | Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.) |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Sigma-Aldrich | UFC801024 | Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa |
Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals | Fisher Scientific | ICN802829 | APS |
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1760 | Ampicillin |
Antivibration Table | Nikon | 63-7590S | |
Avanti J-E Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics | VWR | 90000-760 | Agar |
Biotin | Alfa Aesar | A14207 | |
Bucket-plastic white – 2 gallon | Bon | 84-715 | Water bucket |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 746495 | CaCl2 |
Catalase from bovine liver | Sigma-Aldrich | C40 | |
CFI Plan Apo Lambda 4x Obj | Nikon | MRD00045 | 4x air objective |
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift | Nikon | 96372 | GFP filter cube |
CH-109-1.4-1.5 | TE Technology | CH-109-1.4-1.5 | Thermoelectric Cooler (TEC) |
Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics | Fisher Scientific | C0378 | |
Cooling block | N/A | N/A | Custom milled aluminum |
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400 | Bio-Rad | 1610400 | Triphenylmethane dye |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | D128 | DMSO |
DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC165680050 | DTT |
DOWSIL 340 Heat Sink Compound | Dow | 1446622 | Thermal paste |
ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE | Pharmco by Greenfield Global | 111000200CB05 | Ethanol |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E3889 | EGTA |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 798681 | EDTA |
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone | Fisher Scientific | BP1421 | Tryptone |
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 | Yeast extract |
Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 µm | Polysciences | 18861 | Tracer particles |
Glucose Oxidase from Aspergillus niger | Sigma-Aldrich | G2133 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
GpCpp | Jena Bioscience | NU-405L | Guanosine-5′[(α,β)-methyleno]triphosphate (GMPCPP) |
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater | Amazon | B07428NBCW | Copper wire |
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
Hellmanex III | Sigma-Aldrich | Z805939 | Detergent |
HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP410 | NaHEPES |
High performance blender machine | AIMORES | AS-UP1250 | Blender |
His GraviTrap | GE Healthcare | 11003399 | Gravity Column |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside |
Isopropyl Alcohol 99% | Pharmco by Greenfield Global | 231000099 | Isopropanol |
JA-10 rotor | Beckman Coulter | 369687 | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Sigma-Aldrich | G1501 | K-Glutamate |
Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | L6876 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | MgCl2•6H2O |
MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M5057 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt |
MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid |
MP-3022 | TE Technology | MP-3022 | Thermocouple |
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC138450500 | TEMED |
Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | E112352 | Spectrometer |
Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope | Nikon | MEA54000 | |
Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA81 | UV glue |
Novex Sharp Pre-stained Protein Standard | Thermo Fisher Scientific | LC5800 | Protein standard ladder |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well | Thermo Fisher Scientific | NP0335BOX | SDS gel |
Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 365672 | |
Parafilm PM996 Wrap , 4" Wide; 125 Ft/Roll | Cole-Parmer | EW-06720-40 | Wax film |
Pe 300 ultra Illumination System Single Band , 3mm Light Guide control Pod power supply |
Nikon | PE-300-UT-L-SB-40 | Cool LED Illuminator |
Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 78830 | PMSF |
Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99% | BeanTown Chemical | 129745 | PEP |
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23200 | |
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets | Thermo Fisher Scientific | A32953 | |
PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
Poly(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 81300 | PEG. Average molecular weight 20,000 Da |
Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | P250-500 | KOH |
PowerEase 300W Power Supply (115 VAC) | ThermoFisher Scientific | PS0300 | DC power supply of the gel box |
PS-12-8.4A | TE Technology | PS-12-8.4A | DC power supply of the temperature controller |
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma-Aldrich | P-0294 | PK/LDH |
Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour | Amazon | B005JWA612 | Fish tank pump |
Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells – Novagen | Millipore Sigma | 71403 | Competent cells |
Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel | Amazon | B01MT6JZMR | Microwave for boiling the water |
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | S271-500 | NaCl |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | SDS |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S8282 | NaH2PO4 |
Streptavidin Protein | Thermo Fisher Scientific | 21122 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
TC-720 | TE Technology | TC-720 | Temperature controller |
Tris Base, Molecular Biology Grade – CAS 77-86-1 – Calbiochem | Sigma-Aldrich | 648310 | Tris-HCL |
Type 45 Ti rotor | Beckman Coulter | 339160 | |
Type 70 Ti rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
Type 70.1 Ti rotor | Beckman Coulter | 342184 | |
VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-916 | Paper tapes |
VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 | VWR | 48366-227 | Glass coverslips |
VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium | VWR | 75799-268 | Glass slides |
XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher Scientific | EI0001 | Gel box |
ZYLA 5.5 USB3.0 Camera | Nikon | ZYLA5.5-USB3 | Monochrome CCD camera |