Summary

Generatie van multicellulaire humane primaire Endometriale Organoïden

Published: October 04, 2019
doi:

Summary

Een protocol voor het genereren van menselijke primaire endometriale organoïden die bestaan uit epitheliale en stromale cellen en behouden kenmerken van het inheemse endometrium weefsel wordt gepresenteerd. Dit protocol beschrijft methoden van uteriene weefsel verwerving tot de histologische verwerking van endometriale organoïden.

Abstract

Het menselijk endometrium is een van de meest hormonaal responsieve weefsels in het lichaam en is essentieel voor de vaststelling van de zwangerschap. Dit weefsel kan ook ziek worden en morbiditeit en zelfs de dood veroorzaken. Model systemen om menselijke endometrium biologie te bestuderen zijn beperkt tot in vitro cultuur systemen van enkele celtypen. Bovendien, de epitheelcellen, een van de belangrijkste celtypen van het endometrium, niet goed propageren of behouden van hun fysiologische eigenschappen in de cultuur, en dus ons begrip van endometriale biologie blijft beperkt. We hebben voor de eerste keer endometriale organoïden gegenereerd die bestaan uit zowel epitheliale als stromale cellen van het menselijk endometrium. Deze organoïden vereisen geen exogene steiger materialen en organiseren specifiek zodat epitheelcellen de spheroid-achtige structuur omvatten en gepolariseerd worden met stromale cellen in het midden die collageen produceren en afscheiden. Oestrogeen, progesteron en androgeen receptoren worden uitgedrukt in de epitheliale en stromale cellen en behandeling met fysiologische niveaus van oestrogeen en testosteron bevorderen de organisatie van de organoïden. Dit nieuwe modelsysteem kan worden gebruikt om normale endometriale biologie en ziekte te bestuderen op manieren die voorheen niet mogelijk waren.

Introduction

Het menselijk endometrium lijnen de baarmoederholte en fungeert als het eerste contact voor het embryo tijdens de implantatie. Het endometrium bestaat uit Luminale en klier Epitheelcellen, ondersteunende stromale fibroblasten, endotheel cellen en immuuncellen. Samen vormen deze celtypen het endometrium weefsel dat een van de meest responsieve weefsels is voor geslachts steroïdhormonen1. De veranderingen die optreden tijdens elke menstruatiecyclus zijn opvallend. Er is een adequate groei en herinrichting van het endometrium nodig om de implantatie van embryo’s mogelijk te maken. Afwijkende reactie op oestrogeen en progesteron kan resulteren in een refractair endometrium dat geen succesvolle instelling van de zwangerschap toestaat en zelfs kan resulteren in ziekten zoals endometriale neoplasie.

Om de hormoon responsen en essentiële veranderingen die zich voordoen in het endometrium te bestuderen, zijn cellen uit het baarmoederslijmvlies die uit de patiënten tijdens een operatie of endometriale biopsie zijn gepropageerd, in de celcultuur gekweekt. Endometrium stromale cellen vermenigvuldigen zich bij voorkeur gemakkelijk en propageren, en het proces van differentiatie geïnduceerd door progesteron kan in vitro worden samengevat. Als gevolg hiervan is veel geleerd tijdens dit differentiatieproces, genaamd decidualisatie2,3. Het andere belangrijke celtype in het endometrium, de Luminale en klier Epitheelcellen, echter niet groeien goed als traditionele monolagen, het verliezen van polariteit, steeds senescentie, en met beperkte proliferatieve potentieel. Als gevolg daarvan is er minder bekend van hun biologie en hun rol in het menselijk endometrium. Aangezien veel neoplasie afkomstig is van de epitheelcellen, blijven de mechanismen die gepaard gaan met hyperplasie of transformatie naar kankercellen volledig gedefinieerd. Bovendien, studies hebben vastgesteld dat hormoon respons impliceert de intieme paracrine acties tussen de epitheliale en stromale cellen van het endometrium4,5.

Onlangs werd een driedimensionale (3D) organoïde cultuur van endometrium epitheelcellen vastgesteld door twee onafhankelijke groepen van6,7, die de eerste rapporten zijn van organogeniden gevormd uit endometrium weefsel. Deze organoïden bestonden uit endometrium epitheelcellen ingebed in een eiwit matrix (tabel van materialen) en bevatte geen belangrijk hormonaal responsief compartiment van het baarmoederslijmvlies, de stromale fibroblasten. Aangezien de matrix eiwitten van lot tot lot kunnen variëren en signalering trajecten kunnen activeren die niet noodzakelijkerwijs in het weefsel voorkomen, zou het ideaal zijn om de matrix eiwitten te vervangen door componenten van het endometrium. In de huidige studie, een protocol voor het genereren van steigers-vrije menselijke endometriale organoïden van epitheliale en stromale cellen van het menselijk endometrium wordt gepresenteerd. De aanwezigheid van stromale cellen biedt niet alleen ondersteuning voor Epitheelcellen, maar biedt ook de noodzakelijke paracrine-acties die zijn vastgesteld om belangrijk te zijn voor de respons van het endometrium hormoon4,8,9 .

De nieuwe multicellulaire endometriale organoïde biedt een modelsysteem van het endometrium dat eenvoudig te genereren is en dat zowel epitheliale als stromale cellen bevat. Deze organoïden kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van hormonale veranderingen op de lange termijn en vroege gebeurtenissen van ziekte zoals tumorvorming als gevolg van hormonale onbalans of exogene insulten. De complexiteit van deze organoïden kan uiteindelijk worden uitgebreid met andere celtypen, waaronder endotheel-en immuuncellen met mogelijk myometriale cellen om de Fysiologie van het menselijk weefsel echt te nabootsen.

Protocol

Endometrium monsters werden verzameld van premenopauzale vrouwen die routine hysterectomie ondergaan voor goedaardige baarmoeder condities bij het Northwestern University Prentice Women’s Hospital, volgens een institutioneel Review Board-goedgekeurd protocol. Schriftelijke toestemming werd verkregen van alle vrouwen die in de studie waren opgenomen. 1. bereiding van agarose-mallen Voorafgaand aan het begin van de celisolatie, gegoten en equilibraten 1,5% agarose micro mallen (<strong…

Representative Results

Een schematische voorstelling van het protocol is afgebeeld in Figuur 1. Baarmoeder weefsel werd verkregen uit een operatie nadat het werd onderzocht door pathologen. Het baarmoederslijmvlies werd van het myometrium gescheiden door schrapen en het endometriale weefsel werd enzymatisch verteerd naar cellen zoals beschreven in het protocol. Epitheliale en stromale cellen werden toegevoegd in micro putten in de agarose mallen. Na 7 dagen in de cultuur werden organoïden behandeld met E en T ged…

Discussion

We hebben menselijke endometriale organoïden gegenereerd die bestaan uit epitheliale en stromale cellen van het endometrium zonder het gebruik van exogene steiger materialen. Hoewel het al is aangetoond dat primaire endometrium epitheelcellen organoïden6,7, deze cellen werden ingebed in een gelatineuze matrix van eiwitten uitgescheiden door muis Sarcoom cellen (Zie tabel van materialen) om te helpen vormen spheroid-achtige structuren. Bovendien…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Deze studie werd gefinancierd door NIEHS/NIH/NCATS UG3 Grant (ES029073) en Northwestern Feinberg school of Medicine Bridge Fund (JJK). Wij willen de noordwestelijke pathologie kern faciliteit voor de verwerking van de vaste organoïden voor paraffine insluiten erkennen. We willen het hele UG3 team erkennen, inclusief de Labs Woodruff, Burdette en Urbanek, voor de inzichtelijke discussies en samenwerkingen.

Materials

Agarose HS, molecular biology grade Denville Scientific CA3510-6
Agarose molds Sigma-Aldrich Z764043 (https://www.microtissues.com/)
Ammonium chloride (NH4Cl) Amresco 0621
β-Estradiol Sigma-Aldrich E2257
Collagenase, Type II, powder Thermo Fisher Scientific 17101015
Dispase Corning 354235
DNase I Sigma-Aldrich D4513
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Eosin Stain VWR 95057-848
Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody Thermo Fisher Scientific RM-9101-S
Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium Sigma-Aldrich F6057
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Corning 21-022-CV 1x without calcium, magnesium, and phenol red
Hematoxylin Stain Solution Thermo Fisher Scientific 3530-32 Modified Harris formulation, mercury free
Heparin solution STEMCELL Technologies 07980 added to MammoCult media
Hydrocortisone stock solution STEMCELL Technologies 07925 added to MammoCult media
Organoid media – Mammocult STEMCELL Technologies 05620 supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone
Paraformaldehyde, 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Phosphate buffered saline, pH 7.4 Sigma-Aldrich P3813
Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant Agilent Technologies M356801-2
protein matrix – Matrigel BD Biosciences 356231
Purified mouse anti-E-cadherin antibody BD Biociences 610181 Clone 36
Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776] Abcam ab92547
RNA lysis and isolation kit Zymo Research R2060
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S6014
Testosterone Sigma-Aldrich 86500
Trichrome Stain Abcam ab150686
Wax film – Parafilm VWR 52858-000

References

  1. Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. The endocrine and paracrine control of menstruation. Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).
  2. Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives. Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).
  3. Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).
  4. Li, Q., et al. The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2. Science. 331 (6019), 912-916 (2011).
  5. Wetendorf, M., DeMayo, F. J. The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network. Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).
  6. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  7. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  8. Kurita, T., et al. Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis. Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).
  9. Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer. Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).
  10. Bui, H. N., et al. Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay. Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).
  11. Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. , (2019).

Play Video

Cite This Article
Murphy, A. R., Wiwatpanit, T., Lu, Z., Davaadelger, B., Kim, J. J. Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids. J. Vis. Exp. (152), e60384, doi:10.3791/60384 (2019).

View Video