Summary

多細胞ヒト初等子宮内膜オルガノイドの生成

Published: October 04, 2019
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Summary

上皮細胞と間質細胞からなるヒト原発性子宮内膜オルガノイドを生成し、天然子宮内膜組織の特性を保持するプロトコルが提示される。このプロトコルは、子宮組織獲得から子宮内膜オルガノイドの組織処理までの方法を記述する。

Abstract

ヒト子宮内膜は、体内で最もホルモン応答性の組織の一つであり、妊娠の確立に不可欠です。この組織はまた、病気になり、罹患率、さらには死を引き起こす可能性があります。ヒト子宮内膜生物学を研究するモデルシステムは、単一細胞型のインビトロ培養系に限定されている。また、子宮内膜の主要な細胞型の一つである上皮細胞は、培養中に生理的形質をうまく伝播したり保持したりしないため、子宮内膜生物学に対する理解は限られています。ヒト子宮内膜の上皮細胞と間質細胞の両方からなる子宮内膜オルガノイドを初めて生成しました。これらのオルガノイドは、外因性足場材料を必要とせず、上皮細胞がスフェロイド様構造を包含し、コラーゲンを産生し分泌する中心の間質細胞と偏光するように特異的に組織化する。エストロゲン, プロゲステロンおよびアンドロゲン受容体は、上皮および間質細胞で発現され、エストロゲンとテストステロンの生理学的レベルで治療は、オルガノイドの組織を促進します.この新しいモデルシステムは、以前は不可能だった方法で正常な子宮内膜生物学と疾患を研究するために使用することができます。

Introduction

ヒト子宮内膜は子宮腔を直線し、移植中に胚の最初の接触として機能する。子宮内膜は、ルミナルおよび腺上皮細胞、支持性間質線維芽細胞、内皮細胞および免疫細胞から構成される。一緒に, これらの細胞タイプは、性ステロイドホルモン1に最も応答性の組織の一つである子宮内膜組織を構成します。.各月経周期の間に起こる変化は顕著です。子宮内膜の適切な成長および改造は、胚移植が起こることを可能にするために必要とされる。エストロゲンおよびプロゲステロンに対する異常な応答は、妊娠の確立を可能にしない難治性子宮内膜をもたらし、子宮内膜新生物を含む疾患をもたらす可能性さえある。

子宮内膜で起こるホルモン応答および本質的な変化を研究するために、手術中または子宮内膜生検中に患者から取り除かれた子宮内膜組織からの細胞は、細胞培養において伝播されている。子宮内膜間質細胞は、好ましく増殖し、容易に伝播し、プロゲステロンによって誘導される分化のプロセスは、インビトロで要約することができる。その結果、この分化プロセスの間に多くのことが学び、デシデュアル化2、3と呼ばれる。しかし、子宮内膜の他の主要な細胞型は、発光および腺上皮細胞は、従来の単層と同様に成長せず、極性を失い、老化し、増殖性が限られている。その結果、ヒト子宮内膜における生物学およびその役割についてはあまり知られていない。多くの新生物が上皮細胞に由来するにつれて、過形成または癌細胞への形質転換に関連するメカニズムは完全に定義されたままである。さらに、研究は、ホルモン応答が子宮内膜4、5の上皮細胞と間質細胞との間の親密なパラクリン作用を伴うことを確立した。

近年、子宮内膜上皮細胞の3次元(3D)オルガノイド培養が、子宮内膜組織から形成されたオルガノイドの最初の報告である2つの独立した基6,7によって確立された。これらのオルガノイドは、タンパク質マトリックス(材料の表)内に埋め込まれた子宮内膜上皮細胞から構成され、子宮内膜子宮内膜の重要なホルモン応答性コンパートメント、間質線維芽細胞を含んでいなかった。マトリックスタンパク質はロットごとに異なり、組織内で必ずしも発生しないシグナル伝達経路を引き起こす可能性があるため、マトリックスタンパク質を子宮内膜の成分に置き換えるのが理想的です。本研究では、ヒト子宮内膜の上皮細胞および間質細胞の足場のないヒト子宮内膜オルガノイドを生成するプロトコルが提示されている。間質細胞の存在は、上皮細胞の支持を提供するだけでなく、子宮内膜ホルモン応答4、8、9のために重要であることが確立された必要なパラクリン作用を提供する.

新しい多細胞子宮内膜オルガノイドは、生成が簡単で、上皮細胞と間質細胞の両方を組み込む子宮内膜のモデルシステムを提供します。これらのオルガノイドは、ホルモンの不均衡や外因性侮辱による腫瘍形成などの疾患の長期的なホルモン変化および初期の事象を研究するために使用することができる。これらのオルガノイドの複雑さは、最終的には、本当に人間の組織生理学を模倣するために、おそらくミオメトリオ細胞を持つ内皮および免疫細胞を含む他の細胞タイプを含むように拡張することができる。

Protocol

子宮内膜サンプルは、ノースウェスタン大学プレンティス女性病院で良性子宮状態のための日常的な子宮摘出術を受けている閉経前の女性から採取された。書面による同意は、研究に含まれるすべての女性から得られた。 1. アガロース金型の調製 細胞の単離を開始する前に、鋳造し、メーカーの指示に従ってオルガノイドを収容するために1.5%アガロースマイク?…

Representative Results

プロトコルの概略図を図 1 に示します。子宮組織は病理学者によって検査された後、手術から得られた。子宮内膜の内層を掻き取ることによってミオメリウムから分離し、子宮内膜組織をプロトコルで概説したように細胞に酵素的に消化した。上皮および間質細胞をアガロース型のマイクロウェルに添加した。培養7日後、オルガノイドをさらに7−14日間EおよびTで処理?…

Discussion

外因性足場材料を用いずに子宮内膜の上皮細胞と間質細胞からなるヒト子宮内膜オルガノイドを生成した。原発性子宮内膜上皮細胞がオルガノイド6、7を形成できることが既に示されているが、これらの細胞はマウス肉腫細胞によって分泌されるタンパク質のゼラチン状マトリックスに埋め込まれた(材料の表を参照)。球状構造を形成?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

本研究は、NIEHS/NIH/NCATS UG3助成金(ES029073)とノースウェスタンファインバーグ医学部ブリッジ基金(JJK)が資金提供を受けました。パラフィン埋め込みのための固定オルガノイドを処理するためのノースウェスタン病理学コア施設を認めたい。ウッドラフ、バーデット、アーバネックのラボを含むUG3チーム全体に対して、洞察に満ちたディスカッションとコラボレーションを行いたいと思います。

Materials

Agarose HS, molecular biology grade Denville Scientific CA3510-6
Agarose molds Sigma-Aldrich Z764043 (https://www.microtissues.com/)
Ammonium chloride (NH4Cl) Amresco 0621
β-Estradiol Sigma-Aldrich E2257
Collagenase, Type II, powder Thermo Fisher Scientific 17101015
Dispase Corning 354235
DNase I Sigma-Aldrich D4513
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Eosin Stain VWR 95057-848
Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody Thermo Fisher Scientific RM-9101-S
Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium Sigma-Aldrich F6057
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Corning 21-022-CV 1x without calcium, magnesium, and phenol red
Hematoxylin Stain Solution Thermo Fisher Scientific 3530-32 Modified Harris formulation, mercury free
Heparin solution STEMCELL Technologies 07980 added to MammoCult media
Hydrocortisone stock solution STEMCELL Technologies 07925 added to MammoCult media
Organoid media – Mammocult STEMCELL Technologies 05620 supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone
Paraformaldehyde, 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Phosphate buffered saline, pH 7.4 Sigma-Aldrich P3813
Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant Agilent Technologies M356801-2
protein matrix – Matrigel BD Biosciences 356231
Purified mouse anti-E-cadherin antibody BD Biociences 610181 Clone 36
Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776] Abcam ab92547
RNA lysis and isolation kit Zymo Research R2060
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S6014
Testosterone Sigma-Aldrich 86500
Trichrome Stain Abcam ab150686
Wax film – Parafilm VWR 52858-000

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Cite This Article
Murphy, A. R., Wiwatpanit, T., Lu, Z., Davaadelger, B., Kim, J. J. Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids. J. Vis. Exp. (152), e60384, doi:10.3791/60384 (2019).

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