توليد العضوية متعددة الخلايا الإنسان الاساسيه بطانة الرحم
Summary
يتم تقديم بروتوكول لتوليد الهيكل الأساسي لبطانة الرحم البشرية الاوليه التي تتكون من الخلايا الظهاريه واللحمية والاحتفاظ بخصائص نسيج بطانة الرحم الأصلي. يصف هذا البروتوكول الطرق من اكتساب انسجه الرحم إلى المعالجة النسيجية لهيكل بطانة الرحم.
Abstract
بطانة الرحم البشرية هي واحده من الانسجه الأكثر استجابه هرمونيا في الجسم وضروري لأقامه الحمل. هذا النسيج يمكن أيضا ان تصبح مريضه وتسبب الاعتلال وحتى الموت. واقتصرت النظم النموذجية لدراسة بيولوجيا بطانة الرحم البشرية علي نظم الاستزراع الأنبوبي لأنواع الخلايا المفردة. الاضافه إلى ذلك ، فان الخلايا الظهاريه ، واحده من أنواع الخلايا الرئيسية لبطانة الرحم ، لا تنتشر بشكل جيد أو الاحتفاظ بصفاتها الفسيولوجية في الثقافة ، التالي فهمنا لعلم الاحياء بطانة الرحم لا يزال محدودا. لقد ولدت ، للمرة الاولي ، الهيكل التنظيمي لبطانة الرحم التي تتكون من الخلايا الظهاريه واللحمية من بطانة الرحم البشرية. هذه العضوية لا تتطلب اي مواد سقالة الخارجية وتنظيم علي وجه التحديد بحيث الخلايا الظهاريه تشمل الهيكل الشبيه كروي وتصبح مستقطبه مع الخلايا اللحمية في المركز الذي ينتج وتفرز الكولاجين. يتم التعبير عن الاستروجين ، البروجسترون ومستقبلات الاندروجين في الخلايا الظهاريه واللحمية والعلاج مع المستويات الفسيولوجية من الاستروجين والتستوستيرون تعزيز تنظيم الهيكل التنظيمي. ويمكن استخدام هذا النظام نموذج جديد لدراسة البيولوجيا بطانة الرحم العادية والمرض بطرق لم تكن ممكنة من قبل.
Introduction
بطانة الرحم البشرية التجويف الرحمي وتعمل كاول اتصال للجنين اثناء الغرس. وتتكون بطانة الرحم من الخلايا الظهاريه المضيءه والغديه ، والخلايا الليفية الداعمة للورم ، والخلية البطانية والخلايا المناعية. معا, هذه الأنواع الخلية تشكل انسجه بطانة الرحم التي هي واحده من الانسجه الأكثر استجابه لهرمونات الستيرويد الجنس1. التغييرات التي تحدث خلال كل دوره الحيض ملفتة للنظر. مطلوب النمو المناسب وأعاده تشكيل بطانة الرحم للسماح لزرع الاجنه ان يحدث. الاستجابة الشاذة للاستروجين والبروجستيرون يمكن ان يؤدي إلى بطانة الرحم الحرارية التي لا تسمح للنجاح في إنشاء الحمل ويمكن ان يؤدي حتى في الامراض بما في ذلك أورام بطانة الرحم.
من أجل دراسة الاستجابات الهرمونية والتغييرات الاساسيه التي تحدث في بطانة الرحم ، تم نشر الخلايا من انسجه بطانة الرحم التي تم استئصالها من المرضي اثناء الجراحة أو خزعة بطانة الرحم في ثقافة الخلايا. تنتشر الخلايا اللحمية لبطانة الرحم بشكل تفضيلي وتنتشر بسهوله ، ويمكن تلخيص عمليه التمايز التي يسببها البروجسترون في المختبر. ونتيجة لذلك ، تم تعلم الكثير خلال عمليه التفريق هذه ، التي سميت ديسيدواليزيشن2،3. نوع الخلية الرئيسية الأخرى في بطانة الرحم ، والخلايا الظهاريه التلالؤ والغديه ، ومع ذلك ، لا تنمو بشكل جيد كما أحادي الطبقات التقليدية ، وفقدان القطبية ، وتصبح السكون ، ووجود إمكانات محدوده التكاثري. ونتيجة لذلك ، فان اقل ما يعرف عن علم الاحياء ودورها في بطانة الرحم البشرية. وبما ان العديد من الأورام تنشا من الخلايا الظهاريه ، تظل أليات المرتبطة بفرط التنسج أو التحول إلى الخلايا السرطانية محدده بالبالكامل. وعلاوة علي ذلك, وقد وضعت دراسات ان الاستجابة هرمون ينطوي علي الإجراءات الحميمة paracrine بين الخلايا الظهاريه واللحمية من بطانة الرحم4,5.
في الاونه الاخيره ، تم تاسيس الثقافة العضوية ثلاثية الابعاد (3d) من الخلايا الظهاريه بطانة الرحم من قبل مجموعتين مستقلتين6،7، والتي هي التقارير الاولي من العضوية التي تشكلت من انسجه بطانة الرحم. وتتالف هذه العضوية من الخلايا الظهاريه بطانة الرحم جزءا لا يتجزا من مصفوفة البروتين (جدول المواد) ولم تشمل مقصوره استجابه الهامه هرمونيا من بطانة رحم بطانة الرحم ، والليفية اللحمية. كما يمكن ان تختلف البروتينات مصفوفة من الكثير إلى الكثير ، ويمكن ان تؤدي إلى مسارات الإشارات التي لا تحدث بالضرورة في الانسجه ، فانه سيكون من المثالي لاستبدال البروتينات مصفوفة مع مكونات بطانة الرحم. في الدراسة الحالية ، يتم تقديم بروتوكول لتوليد الهيكل العضوي الخالي من السقالات من الخلايا الظهاريه واللحمية من بطانة الرحم البشرية. وجود الخلايا اللحمية لا يوفر فقط الدعم للخلايا الظهاريه ولكنه يوفر أيضا الإجراءات الضرورية paracrine التي تم إنشاؤها لتكون مهمة لاستجابه هرمون بطانة الرحم4,8,9 .
العضوية الجديدة لبطانة الرحم متعددة الخلايا تقدم نظاما نموذجيا لبطانة الرحم التي هي بسيطه لتوليد والتي تتضمن كلا من الخلايا الظهاريه واللحمية. ويمكن استخدام هذه العضوية لدراسة التغيرات الهرمونية علي المدى الطويل والاحداث المبكرة من الامراض مثل التورم بسبب عدم التوازن الهرموني أو الشتائم الخارجية. ويمكن في نهاية المطاف توسيع تعقيد هذه الاشكال العضوية لتشمل أنواع الخلايا الأخرى ، بما في ذلك الخلايا البطانية والمناعية مع الخلايا العضلية ربما إلى تقليد حقا فسيولوجيا الانسجه البشرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد ولدت لدينا الإنسان العضوي بطانة الرحم تتكون من الخلايا الظهاريه واللحمية من بطانة الرحم دون استخدام مواد سقالة الخارجية. في حين انه قد تم بالفعل تبين ان الخلايا الظهاريه بطانة الرحم الاوليه يمكن ان تشكل organoids6,7, وقد تم تضمين هذه الخلايا في مصفوفة الجيلا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذه الدراسة من قبل NIHS/المعاهد القومية للصحة/NCATS UG3 غرانت (ES029073) وشمال غرب مدرسه Feinberg كليه الطب جسر الصندوق (JJK). نود ان نعترف بالمرفق الأساسي لعلم الامراض الشمالية الغربية لمعالجه العضوية الثابتة لتضمين البارافين. نود ان نعترف بالفريق UG3 بأكمله بما في ذلك وودروف ، Burdette ، ومختبرات اوربريك للمناقشات الثاقبة والتعاون.
Materials
| Agarose HS, molecular biology grade | Denville Scientific | CA3510-6 | |
| Agarose molds | Sigma-Aldrich | Z764043 | (https://www.microtissues.com/) |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Amresco | 0621 | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | |
| Collagenase, Type II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| Dispase | Corning | 354235 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Eosin Stain | VWR | 95057-848 | |
| Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9101-S | |
| Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1x without calcium, magnesium, and phenol red |
| Hematoxylin Stain Solution | Thermo Fisher Scientific | 3530-32 | Modified Harris formulation, mercury free |
| Heparin solution | STEMCELL Technologies | 07980 | added to MammoCult media |
| Hydrocortisone stock solution | STEMCELL Technologies | 07925 | added to MammoCult media |
| Organoid media – Mammocult | STEMCELL Technologies | 05620 | supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone |
| Paraformaldehyde, 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant | Agilent Technologies | M356801-2 | |
| protein matrix – Matrigel | BD Biosciences | 356231 | |
| Purified mouse anti-E-cadherin antibody | BD Biociences | 610181 | Clone 36 |
| Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776] | Abcam | ab92547 | |
| RNA lysis and isolation kit | Zymo Research | R2060 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Testosterone | Sigma-Aldrich | 86500 | |
| Trichrome Stain | Abcam | ab150686 | |
| Wax film – Parafilm | VWR | 52858-000 |
References
- Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. The endocrine and paracrine control of menstruation. Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).
- Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives. Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).
- Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).
- Li, Q., et al. The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2. Science. 331 (6019), 912-916 (2011).
- Wetendorf, M., DeMayo, F. J. The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network. Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).
- Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
- Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
- Kurita, T., et al. Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis. Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).
- Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer. Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).
- Bui, H. N., et al. Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay. Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).
- Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. , (2019).
