פרוטוקול להפקת האנושי הראשי אורגנואידים רירית הרחם המורכבים של תאים אפיתל וסטרומה ולשמור מאפיינים של רקמת רירית הרחם היליד מוצג. פרוטוקול זה מתאר שיטות מרכישת רקמת הרחם לעיבוד היסטולוגית של אורגנואידים רירית הרחם.
רירית האדם האנושי הוא אחד הרקמות הורמונאלי ביותר בגוף והוא חיוני להקמת ההריון. רקמה זו יכולה גם להיות חולה ולגרום לתחלואה ואפילו מוות. מערכות מודל ללמוד ביולוגיה רירית הרחם האנושי הוגבלה במערכות תרבות מבחנה של סוגי תאים בודדים. בנוסף, התאים האפיתל, אחד מסוגי התא העיקריים של רירית הרחם, לא מופצים היטב או לשמור על התכונות הפיזיולוגיות שלהם בתרבות, ולכן ההבנה שלנו של ביולוגיה רירית הרחם נשאר מוגבל. יצרנו, בפעם הראשונה, אורגנואידים רירית הרחם המורכבים משני התאים האפיתל ו סטרומה של האנדורירית האנושי. אורגנואידים אלה אינם דורשים כל חומר הגרדום האקסוגני ובמיוחד לארגן כך תאים אפיתל להקיף את המבנה דמוי ספרואיד ולהיות מקוטב עם תאים סטרומה במרכז המייצרים ומפרישות קולגן. אסטרוגן, פרוגסטרון וקולטנים אנדרוגן מבוטא בתאי אפיתל, סטרומה וטיפול ברמות פיזיולוגיות של אסטרוגן וטסטוסטרון לקדם את הארגון של האורגנואידים. מערכת זו מודל חדש יכול לשמש כדי ללמוד ביולוגיה רירית הרחם נורמלי מחלות בדרכים שלא היו אפשריות לפני.
רירית הרחם האנושי קווי החלל הרחמי ומשמש כאיש הקשר הראשון עבור העובר בזמן השרשה. רירית האנדויום מורכב של לומיאל ותאים אפיתל הבלוטות, מסטרומה, בתאי האנדותל ותאי החיסון התומכים. יחד, אלה סוגים תא להפוך את רקמת רירית הרחם שהיא אחת הרקמות התגובה ביותר כדי למין הורמונים סטרואידים1. השינויים המתרחשים בכל מחזור וסת מרשימים. הצמיחה המתאימה שיפוץ של רירית המוח נדרש כדי לאפשר השתלת העובר להתרחש. התגובה החריגה אסטרוגן ופרוגסטרון יכול לגרום לרירית הרחם עקשן כי אינו מאפשר הקמתה מוצלחת של ההריון והוא יכול גם לגרום למחלות כולל רירית הרחם neoplasia.
על מנת ללמוד את התגובות הורמון ושינויים חיוניים המתרחשים רירית הרחם, תאים מרקמות רירית הרחם מקבל מטופלים במהלך ניתוח או ביופסיה רירית הרחם הופץ בתרבות התא. תאים סטרומה רירית הרחם מעדיפים להתרבות ולהפיץ בקלות, ותהליך של בידול הנגרמת על ידי פרוגסטרון יכול להיות מסכם מבחנה. כתוצאה מכך, הרבה למדו בתהליך בידול זה, כינה את דצידוליזציה2,3. הסוג השני של התא העיקרי רירית העין, הלומיאל ותאים אפיתל הבלוטות, עם זאת, לא לגדול גם monolayers המסורתית, לאבד קוטביות, להיות הסנדק, ולאחר פוטנציאל מתרבים מוגבלת. כתוצאה מכך, פחות ידוע של הביולוגיה שלהם ואת תפקידם באנדורירית האנושי. כמו neoplasia רבים מקורם בתאי האפיתל, מנגנונים הקשורים היפרפלזיה או טרנספורמציה לתאי סרטן להישאר מוגדרים לחלוטין. יתר על כן, מחקרים הקימו כי תגובת הורמון כרוך פעולות הפרדרין אינטימי בין התאים אפיתל ו סטרומה של רירית האנדויום4,5.
לאחרונה, התרבות האורגאידית תלת-ממדית של תאים אפיתל רירית הרחם הוקמה על ידי שתי קבוצות עצמאיות6,7, שהן הדיווחים הראשונים של אורגנואידים שנוצרו רקמת רירית הרחם. האורגנואידים האלה היו מורכבים של תאים אפיתל רירית הרחם מוטבע בתוך מטריצת חלבון (הטבלה של חומרים) ולא כללה תא חשוב ורמונאלי תגובה של רירית הרחם רירית, סטרומה. כמו חלבונים מטריקס יכול להשתנות הרבה הרבה והוא יכול להפעיל מסלולים איתות כי לא בהכרח להתרחש ברקמה, זה יהיה אידיאלי כדי להחליף את החלבונים מטריקס עם רכיבים של רירית העור. במחקר הנוכחי, פרוטוקול לייצר לגרדום ללא האדם אורגנואידים רירית הרחם של תאים אפיתל ו סטרומה של האנדורירית האנושי מוצג. הנוכחות של תאים סטרומה לא רק מספק את התמיכה עבור תאים אפיתל אלא גם מספק את פעולות הפרפרין הדרושים אשר הוקמו להיות חשוביםעבור תגובה הורמון ריריתהרחם 4,8,9 .
אורגאיד החדש של רירית הרחם מציעה מערכת מודל של רירית הרחם כי הוא פשוט לייצר והמשלבת הן תאים אפיתל ו סטרומה. אורגנואידים אלה יכולים לשמש ללימוד שינויים הורמונליים לטווח ארוך ואירועים מוקדמים של מחלות כגון tumorigenesis בשל חוסר איזון הורמונלי או עלבונות אקסוגני. המורכבות של האורגנואידים האלה יכול בסופו של דבר להתרחב כדי לכלול סוגי תאים אחרים, כולל התאים אנדותל והחיסון עם תאים myometrial שפט באמת לחקות את הפיזיולוגיה של רקמת האדם.
יצרנו אורגנואידים רירית האדם מורכב של תאים אפיתל ו סטרומה של רירית הרחם ללא שימוש בחומרים לגרדום אקסוגני. אמנם זה כבר הוכח כי תאים הראשי האפיתל רירית הרחם יכול ליצור אורגנואידים6,7, תאים אלה היו מוטבעים במטריצה ז’לטין של חלבונים שמופרשים על ידי תאי סרקומה של …
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה מומן על ידי הUG3 מענק (ES029073) ובית הספר נורת’ווסטרן פיינברג לרפואה גשר של הקרן (JJK). היינו רוצים להכיר את מתקן ליבת הפתולוגיה הצפון-מערבי לעיבוד האורגנואידים הקבועים להטבעת פרפין. היינו רוצים להכיר בצוות הUG3 כולו, כולל מעבדות וודרוף, בורדט ואורנק לדיונים ושיתופי פעולה בתובנה.
Agarose HS, molecular biology grade | Denville Scientific | CA3510-6 | |
Agarose molds | Sigma-Aldrich | Z764043 | (https://www.microtissues.com/) |
Ammonium chloride (NH4Cl) | Amresco | 0621 | |
β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | |
Collagenase, Type II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
Dispase | Corning | 354235 | |
DNase I | Sigma-Aldrich | D4513 | |
EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
Eosin Stain | VWR | 95057-848 | |
Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9101-S | |
Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1x without calcium, magnesium, and phenol red |
Hematoxylin Stain Solution | Thermo Fisher Scientific | 3530-32 | Modified Harris formulation, mercury free |
Heparin solution | STEMCELL Technologies | 07980 | added to MammoCult media |
Hydrocortisone stock solution | STEMCELL Technologies | 07925 | added to MammoCult media |
Organoid media – Mammocult | STEMCELL Technologies | 05620 | supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone |
Paraformaldehyde, 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813 | |
Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant | Agilent Technologies | M356801-2 | |
protein matrix – Matrigel | BD Biosciences | 356231 | |
Purified mouse anti-E-cadherin antibody | BD Biociences | 610181 | Clone 36 |
Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776] | Abcam | ab92547 | |
RNA lysis and isolation kit | Zymo Research | R2060 | |
Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
Testosterone | Sigma-Aldrich | 86500 | |
Trichrome Stain | Abcam | ab150686 | |
Wax film – Parafilm | VWR | 52858-000 |