オミクスアプローチに対するショウジョウバエメラノガスター飛行筋肉の解剖

上記の解剖プロトコルは、成人期まで、パパリウム形成(APF)後16時間からIFM富化サンプルを生成するのに有用である。解剖された飛行筋肉サンプルは、複数のアプリケーションに使用することができ、これまでのところ、RT-PCR4、17、RNA-Seq16、32、ChIP36、37、西洋に正常に適用されていますブロッティング14、41および質量分析実験(下記参照)。RNA ベースのアプリケーションを解剖する潜在的なユーザーを支援するために、まず、IFM からの RNA の分離に関する重要な考慮事項を強調する結果を示します。解剖プロトコルの有用性をより広く実証するために、RNA結合タンパク質Bruno1に関するデータを使用して、可能な-omicsアプリケーションのいくつかを説明します。 IFM解剖プロトコルは、高品質のRNAを生み出します コードmRNAは全RNA42のわずか1~5%しか構成されないと推定されるので、予め解剖されるハエの数を決定することが重要である。1d成人から解剖したIFMからフライ当たりの総RNAの平均24±9ngを得た(図4Fおよび補足図1A)。このフライ当たりの総RNAの収量は比較的一定であり、16h APF、24h APF、30 h APF、48 h APF、72 h APFおよび90 h APF(図4Fおよび補足図1B、D,E)で解剖されたIFMについて約25ng変動する。これらの観察はまた、脂肪、腱、気管または他の細胞タイプを汚染から単離された任意のRNAを反映し、以前の時点から単離されたサンプルで高い可能性があります。そこで、50ハエからIFMから総RNAの>1 μgを得て、通常100~150ハエからIFMを解剖し、RNA-Seqサンプルの総RNAの>3 μgを生成しました。 RNA単離の方法は、回収されたRNAの量と質に影響を与え、ユーザーが単離アプローチを検証することを奨励します。例えば、方法1を用いた単離は、50 1 d大人のハエからIFMからの総RNAの平均1143±465ngを生成するが、様々な市販キットとの単離は、186±8 ngから1261±355ngの総RNA(図4Gおよび補足図 1C)市販キットから単離されたRNAは、一般的に良好な品質である(図4Hおよび補足図1F)が、低い回収はRNAがカラムから効率的にelelyが行われない可能性を示唆している。RNAの完全性はまた、方法2(図4H、第2プロット)で行われるようにキットを使用することによって損なわれ、バッファー体質および熱処理に起因する可能性が高く、下流実験に影響を与えうる重大な断片化を引き起こす可能性がある。 また、RNAサンプルを分離して取り扱う際には、適切なRNaseフリー技術を観察することも重要です。凍結融解サイクルと4時間室温インキュベーションはRNA完全性プロファイルに劇的な影響を与えませんが、少量のRNaseでも急速なRNA分解につながります(図4Iおよび補足法)。ユーザーはまだ氷に取り組み、RNA加水分解と断片化を防ぐために凍結融解を制限することをお勧めします。これはここで検出されませんでしたが、フィルタチップとDEPC処理バッファを使用してRNase汚染を防ぐことは絶対に不可欠です。 逆転写の効率は、ダウンストリームアプリケーションの成功にも影響を与えます。我々がテストした3つの市販RTキットのうち2つで信頼できる結果を得たが、これはいずれもリボソーム遺伝子rp49に対する強力なRT-PCRバンドを増幅する(図4J)。しかし、RTキット#2は、3つの生物学的複製物すべてに対してRNA結合タンパク質bru1に対してより強いバンドを得たため、低発現転写物の検出に対してより敏感である可能性がある(図4J)。これらの結果をまとめると、この手順で解剖されたIFMから高品質のRNAを単離できることを示しています。 解剖されたIFMは、高品質のmRNA-Seqおよびプロテオミクスデータを生成する 上記のプロトコルに従って解剖されたIFMを30 h APF、72 h APFおよび1d大人のハエから、我々は以前にRNA結合タンパク質およびCELF1-ホモログブルーノ1(Bru1、アレスト、アレット)が下流のIFM特異的スプライシング経路を制御することを示した。転写因子スパルトメジャー(サルム)16.ヌル変異体からのIFMだけでなく、筋肉特異的なbruno1 RNAi(bru1-IR)は、サルコメア成長欠陥、ミオシン活性の誤った調節、最終的には筋線維の過収縮および損失を示す16,17.以下では、プロテオーム質量分析全体に対する解剖IFMの有用性を示し、RNAレベルで観察された発現変化のいくつかがタンパク質レベルでも明らかであることを示す。さらに、Bruno1によって調節されたMhcにおける特定の発達スプライス事象を強調し、mRNA-SeqおよびRT-PCRが解剖されたIFMから代替スプライス事象の調節を実証するために使用できることを示した。 ライブラリーの品質と深さに応じて、mRNA-Seqデータは遺伝子単位のレベル(遺伝子のすべてのエキソン、個々のエキソン、またはスプライスジャンクションの平均読み取り数)で分析できます。野生型と比較したbru1-IR IFMからのmRNA-Seqデータは、遺伝子ユニットレベル16における発現の弱い変化を示す(図5A)。72 h APFでは、60A[Mlp60A]、アクチン57B[Act57B]、筋肉特異的タンパク質300kDa[Msp300]、またはストレッチン・ムルク[Strn-Mlck]などのサルコメア遺伝子が既に規制下に重要な傾向にあります。bru1-IR筋肉(図5Aおよび補足表1)。しかし、我々は以前に、個々のエキソンのレベルでは、特定のサルコメア遺伝子アイソフォーム16のはるかに強いダウンレギュレーションがあることを示し、Bruno1の主な機能は代替スプライシングを制御することであることを示唆している(補足表1)). 解剖IFM上の全プロテオーム質量分析を用いて、タンパク質レベルに対して同様の調節を示すことができる(図5Bおよび補足表2)。検出された1,895のペプチド群のうち、524(28%)。そのうちの1d成人ではBru1M2変異IFMで誤って規制されている(補足表2)。Strn-MlckおよびMlp60Aタンパク質の両方のダウンレギュレーションも観察され、mRNA-Seqデータの転写レベルでの一致した観察と一致する。特定のタンパク質アイソフォームにマップするデータベースペプチドの数は限られているが(分析の詳細については補足的な方法を参照)、サルコメアタンパク質トロポミオシン1(Tm1)、支持(アップ/TnT)、Mhc、曲がり(bt/プロジェクティン)およびパラミオシン(Prm)についてあるアイソフォームからのペプチドのアップレギュレーションと別のアイソムのダウンレギュレーションを観察し(図5B)、RNAレベル16に関する同様の調節の以前の観察を確認する。これは、解剖されたIFMがmRNA-Seqおよびプロテオミクスアプリケーションの両方に有用であることを示しています。 オミクスデータが生物学的洞察を高め、拡張するための従来のアプローチを補完する方法のさらなる例として、我々はMhcのC終産でスプライシングに焦点を当てることを選んだ。weeP26と呼ばれる以前に特徴付けられたタンパク質トラップラインは、Mhc43,44の最終イントロンに挿入される(正確な位置については補足的な方法を参照)。weeP26は強いスプライス受け入れを含み、おそらくすべてのMhc転写物に組み込まれる(図5C)。しかしながら、IFMにおけるGFP標識タンパク質は、M線の両側の2つの「ドット」に組み込まれ、脚筋では、M線を横切って均一に組み込まれ、厚いフィラメントを弱く組み込む(図5E)。オルファノスとスパローは、発達的なMhcアイソフォームスイッチによるIFM形式でこれらの「ドット」を示した:48 h APFの前に発現したMhcアイソフォームは、開いた読み取りフレームにweeP26エクソン挿入物としてGFPラベルが付けられており、MhcはMhc48h APFの後に発現されるアイソフォームは標識が付けられず、weeP26エクソンは3′-UTR44にストップコドンの下流に含まれる。 mRNA-Seqのデータにより、C末端Mhcアイソフォーム発現をより詳細に特徴付けることができました。2つの異なるMhc終端が43、44報告されているが、私たちのmRNA-Seqデータと現在のフライベースアタテーション(FB2019_02)は、実際にMhcで3つの可能な代替スプライスイベントがあることを示唆していますC終生(Exon 34-35、34-36、または34-37)(図5C)は、RT-PCR(図5D)によって確認された。ウィーP26GFP は、エキソン 36 と 37 の間のイントロンに挿入されます。したがって、エクソン34-35およびExon 34-36アイソフォームの両方がストップコドンを含むので、GFPはエクソン34-37アイソフォームでのみ翻訳することができます(結果Exon 34-GFP-37)。さらに、すべてのMhcアイソフォームの時間的および空間的な調節の両方を見ることができました。IFMでは、48h APF(図5)で30h APFと48h APF(図5C,D,F)の間のエクソン34-37からエクソン34-35へのMhcアイソフォームスイッチを27°Cで観察しますが、これは48時間APF(図5E)で免疫蛍光によってまだ見えません。脚は既に30h APFでエキソン34-37とエクソン34-35の混合物を発現し、72h APFは3つのMhcアイソフォームすべてを発現する(図5D,F)。成人ジャンプ筋(TDT)はまた、3つのMhcアイソフォーム(図5F)をすべて発現し、これは一般的に管状体筋に当てはまることを示唆している。したがって、当社のmRNA-Seqデータは、IFMのMhcアイソフォームスイッチの時間枠を狭め、管筋におけるMhcアイソフォーム使用を特徴付けることによって、以前の所見の延長を可能にする。 次いで、サルムおよびbru1変異型IFMにおけるMhcアイソフォーム調節を検討した。いずれの場合も、weeP26の誤った規制が見られた。サルム変異IFMは、Exon 34-36イベントのゲインを含む後の段階でMhcアイソフォーム式および表現脚スプライシングパターンで発達スイッチを完了することができません(図5F)。これは、サルムの損失が管状筋肉16にIFMのほぼ完全な運命の変換をもたらすという以前の知見と一致します.Bru1-IRおよびbru1変異型IFMは、サルム-/-IFMと同様に、成人期を通じてエクソン34-37スプライス事象を保持する(図5E,F)、その結果、脚筋に似たweeP26 GFP標識パターンをもたらし、しかし、それはExon 34-36イベントを得ません。これは、Bruno1がMhc代替スプライシングにおける発達スイッチを少なくとも部分的に制御するためにIFMで必要であることを示唆しているが、追加のスプライシング係数もサルム-/-コンテキストで誤って制御されていることを示している。さらに、この例は、解剖IFMからのRT-PCRおよびmRNA-Seqデータが、発達的スプライシング機構と観察された形態的欠陥をより深く理解するうえでどのように価値があるかを示しています。 図1:子犬のIFM開発とステージング(A)24h APF、32h APF、48 h APF、72 h APF、および1d成人におけるIFM開発の概略図は、〜32h APFでの飛行筋肉(緑)の圧縮および後続の繊維成長を示す胸部を満たす。腱は濃い灰色です。(B)オープンブック解剖(24時間、32h、48h)19または胸部方面切片(72時間、1日)から固定IFMの共焦点画像をアクチン(ローダミンファロイジン、マゼンタ)およびGFP(緑色)用に染色した。(C, D)生きている子犬におけるGFP蛍光の画像は、後部(C)または横(D)平面における解剖フライラインの無傷のIFM形態を示す。アスタリスクは IFM の位置をマークします。(E)解剖の準備をするために、フライストックは3~4日前に反転するか、十字架をセットする必要があります。(F)プレプパエは白色(黄色の矢印)で選択され、濡れたペイントブラシ(F’,F’)を使用して分離されます。(G)Prepupaeは、後部に位置する半透明のボール(黄色のアスタリスク)として現れる精巣の存在に基づいて、女性と男性を分離するために性交されるべきである。(H)プパエは60mmの皿で濡れたフィルターペーパーの上で熟成される。スケールバー = 100 μm (B)、1 cm (C、D、E、H)、1 mm (F、F”,G)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図2:48 h APFより前のIFMの解剖。(A)転写ピペットを付けた黒い解剖皿に1x PBSバッファーを追加する。(B)ペイントブラシを使用した段階的な子犬の移動。(C)GFPを可視化する蛍光解剖顕微鏡の下で、#5鉗子(灰色で輪郭を描く)を用いて解剖皿の底に子犬を優しく押し込む。円の中の「X」は、画像への動きを示します。(D,E)子犬を前もってつかみ(D)、次いで胸郭のすぐ後ろの子犬を突き刺す(E)。円のダッシュは、動きを示しません。(F, G)前鉗子(矢印)で引っ張って、子犬の場合(F)を取り除き、次いで腹部(G)を取り除く。(H)いくつかのpupaに対するC-Gの繰り返し。黄色の点線は、寄与する子犬を示す番号が付けられています。(I, J)鉗子(I)を使用して周囲の組織(J)からIFMを分離する。円の中のドットは、ページ外の動きを示します。(K, L)脂肪およびジャンプ(TDT)筋肉(K)を含む汚染物質の除去は、きれいなIFMサンプル(L)を生成する。TDTはGFP発現が低く、IFMファイバ(K’)とは形状が異なります。(M,N,O)切り取られたピペット先端(M)を使用して解剖されたIFM(N)を収集し、マイクロ遠心管(O)への転送を行う。スケールバー = 1 cm (A,B,M,O)、1 mm (C-G)、500 μm (H-L,N)この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図3:48h APF後のIFMの解剖(A)ダブルスティックテープに子犬の位置合わせ。(B)前を開き(B)、ケースを後部(B’)に切断し、pupa(B’)を持ち上げて、子犬の場合から子犬を取り除く。図 2 と同じ円記号を表します。(C)パペエをバッファーに移す。(D)はさみ(黄色の二重矢印)で切断し、胸部から分離することによって腹部を除去する(D’)。(E, F)クリーンバッファー(E)を添加し、次いで胸郭を半分縦方向に切断する(F,F’)。(G,H)解剖は、GFP(H)を視覚化するために白色光(G)または蛍光の下で行うことができます。一方の側(G’)、次にもう一方の側(G’)のIFMの切断。鉗子(灰色で輪郭を描く)(G”’)で胸郭を持ち上げる。(I,J,K)バッファー内のIFMの収集(I)および汚染された腹神経コード(VNC)、腸、およびジャンプ筋(TDT)(J)の除去は、クリーンなIFMサンプル(K)を生成する。TDTはGFP発現が低く、IFMファイバ(J’,K’)とは異なる形状をしています。(L,M)鉗子を使用してIFM(L)をマイクロ遠心管(M)に移す。スケールバー = 1 cm (A,E,M)、1 mm (B-D’、F-L)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図4:IFM保存およびRNA分離の詳細。(A)IFMは2000 x gで5分間遠心分離によってペレット化される。(B)蛍光下のIFMペレット(矢印)及びペレット(B’)。(C)ピペットチップを使用したすべてのバッファを削除します。(D)RNA抽出の場合、分離バッファー内のペレットの再懸濁。このステップは、凍結解剖IFMにスキップすることができます。(E)液体窒素中またはドライアイスで試料を凍結し、-80°Cで保存する。スケールバー = 10 cm (A)、1 mm (B,B’)、1 cm (C、D、E)。(F)16h APF、24h APF、30 h APF、48 h APF、72 h APF、90 h APF、および 1 d 成人で得られたフライ当たりの解剖IFMからの総RNA(ng)。誤差バー= SD.(G)異なる抽出方法を用いて50 1d大人ハエから解剖したIFMから分離された総RNA。誤差バー = SD.(H)異なる抽出方法後のRNA整合性をアッセイする代表的なトレース。リボソームバンドは、2000ヌクレオチド(nt)のすぐ下に実行され、マーカーバンドは25 nt.補足図1で利用可能な追加のトレース.(I)新たに単離したRNAサンプル(上)の代表的な痕跡、ドライアイス上のサンプル凍結解凍25x(第2プロット)、ベンチ上に4時間放置したサンプル(第3プロット)、およびRNase A(ボトムプロット)で処理したサンプル。ブルー1およびrp49に標識されたキットからRNase A.(J)RT-PCRゲルを添加した際のRNAの完全な分解に注意してください。rp49に対して正規化されたbru1バンドの相対強度を以下にプロットする。誤差記号 = SEM (対になっていないt-test、p = 0.0119)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図5:代替スプライシングにおけるBruno1関数を調査するためのIFM解剖の適用(A)72 h APFで解剖したIFMからのmRNA-Seqデータ(遺伝子単位)の火山プロット。bru1-IRと野生型IFM(padj < 0.05、abs(ログ2FC)>1.5)の間で有意に有意に調節される遺伝子は青色で示され、有意でない遺伝子は灰色で示される。サルコメアタンパク質は赤色で強調表示され、選択された遺伝子には標識が付いています。(B)全プロテオーム質量分析の火山プロットは、1 d成人IFMから得られた結果である。bruM2変異体と野生型(FDR<0.05)の間で有意に異なるタンパク質は、灰色の青色の有意でないタンパク質で示されています。肉腫タンパク質は赤で強調表示されます。(A)の遺伝子に対応するペプチドは、赤色で標識される。同じタンパク質の異なるアイソフォームにマッピングするペプチドのセットは、同じ色で標識される。(C) weeP26遺伝子トラップの明確な転写形位形および挿入位置を示すMhcのC終端のスキーム(挿入点の補足方法を参照)。RT-PCR プライマーは、トランスクリプトの上に黒い線で示されます。mRNA-Seqからの1キロベース当たりの読み取り数(RPKM)は、ワイルドタイプから30h APF(オレンジ)および72 h APF(赤色)、bru1-IR(青)およびサルム-/–(シアン)から72 h APFで、72 h APFで全脚(緑)から解剖されたIFMに対して示されています。.(D)30 h APF 以降のタイムポイントの間の IFM のアイソフォーム スイッチを示すMhcに対するプライマーを持つ RT-PCR。Exon 34-35スプライスイベントは、ブルーM3変異型IFMまたは成人脚でのみ弱く観察されます。(E)ワイルドタイプIFMサルコメアにおけるweeP26 GFP局在化の共焦点画像は、90h APF脚筋と比較して48h APFおよび90 h APFである。スケールバー = 1 μm.(F)標識されたジェノタイプおよびタイムポイントのmRNA-Seqデータからのスプライス接合定量。ジャンクション読み取りは、特定のスプライスイベント(エクソン34~35グレー、紫34~36、緑色の34~37)の比率として、エクソン34スプライスドナーを共有する合計数イベントに対して提示されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 補足図1:(A,B,C)RNAは、同じ週に同じ研究者によって解剖された同じ遺伝子型のサンプルから得られた。すべてのサンプルを解剖した後、RNAを単離し、同じ日に測定した。(A) 1d大人フライ当たりIFM解剖から得られた総RNAのナノグラム(ng)。誤差バー = SEM. (B) 30 h APF、48 h APF、72 h APF および 1 d 成人でフライあたりの解剖 IFM から得られた総 RNA。(C)異なる抽出方法を用いて50 1d大人ハエから解剖したIFMから分離した総RNA。(D)解剖された脚、ジャンプ筋(TDT)およびIFMからのフライ当たりの総RNA濃度。より大きなIFMからより多くのRNAが得られます。誤差範囲 = SD.(E)30 h APF、72 h APF および 1 d 成人の RNAi または変異サンプルと比較して、コントロールから解剖された IFM のフライあたりの総 RNA 濃度。変異体の場合、w1118はワイルドタイプコントロールとして使用されました。変異体データは、bru1-IR、サルム-/-および別のRNA結合タンパク質変異体からコンパイルされます。これらの操作では、筋肉の萎縮と損失のために1d成人でRNA収量が減少するので、より多くのハエを解剖して、オミクスアプローチに十分な量を得る必要があります。エラーバー = SD.(F)図4Gおよび補足図1Cに示すRNA単離法のRNA整合性を示す追加のトレース。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 補足方法:テキスト全体で使用される方法および試薬の詳細な説明、特に、図1A-D、図4F-K、図5、補足表1、および、 補足表 2.これらのデータは解剖プロトコルを動機付け、RNA単離、mRNA-Seq、RT-PCR、およびプロテオミクスに対する有用性を実証する。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 図 5 および本文内の関連段落に関連する タブ名 データの概要 サルコメアタンパク質 Spletter et al. Elife 2018のサルコメア遺伝子の一覧。ここでは、現在のFBgnと遺伝子名を一覧表示します。 SP遺伝子ユニット_DESeq2_72h Spletter et al. EMBO Rep 2015 のデータを使用して、72 h APF の mRNA-Seq データのサルコメア遺伝子を具体的に調べた。これは、コントロール(Mef2-Gal4、UAS-GFM-Gmaがw1118に交差した)とMef2-Gal4、UAS-GFM-Gma x Bruno1-IRとの間の遺伝子単位レベルの微動発現を検出するDESeq2分析から来ています。黄色で強調表示された行は、表示される遺伝子の上下に示すように(log2FC=abs(1.5)のしきい値の上/下)です。これらのデータは、図 5A の赤いドット オーバーレイです。各サルコメア遺伝子について、識別子情報、DESeq2からのlog2FC、P値および調整されたP値、ならびにDESeq2正規化発現数を提供する。 SP エクソン_DEXSeq_72h Spletter et al. EMBO Rep 2015 のデータを使用して、72 h APF の mRNA-Seq データにおけるサルコメア遺伝子エキソンの使用を具体的に調べた。これは、コントロール(Mef2-Gal4、UAS-GFM-Gmaがw1118に交差)とMef2-Gal4、UAS-GFM-Gma x Bruno1-IRとの間の差動エキソン使用を検出するDEXSeq分析から来ています。黄色で強調表示された行は、表示されるレキドキの上下に表示されます (log2FC=abs(1.5)のしきい値の上/下)。我々は、エキソンおよび遺伝子識別子情報、DEXSeqからのlog2FC、P値および調整されたP値、ならびに関連する転写物のリストを提供する。 多くの遺伝子は、多くの場合、高いlog2FC値と低いP値/調整P値を有するDEXSeq分析で1つ以上のエキソンの調節を示し、遺伝子の限られたリストは72 h APFで変化を示すのでご注意ください。これは代替スプライシングの調節にブルーノの損失の強い効果をサポートしています。 補足表1:bru1-IR対野生型IFMにおける差別的発現遺伝子(DESeq2を介して)およびエキソン(DEXSeq経由)を同定するサルコメアタンパク質に関する72h APF mRNA-Seqデータの表。 図 5B および本文の関連段落に関連する タブ名 データの概要 ペルセウス出力 これは、図5Bの生成に用いられる質量分析データを示す処理されたデータスプレッドシートである。IFMサンプルは、1 d大人コントロール(w1118)および変異体(bruno1-M2)ハエから得られた。重要な列は、各サンプルの4つの反復、t検定統計と有意性、ペプチドイドおよび対応する遺伝子名およびFlybaseの名前のそれぞれに対する変換強度値です。シグニチュードはペルセウス州の標準設定 (FDR<.05) を使用して計算されました。検出されたタンパク質/ペプチドは1859個あり、そのうち524個(28%)が検出されました。サンプル間で有意に異なります。 ダウン規制 これらは、bruno1-M2変異型IFMでダウンレギュレートされたペルセウス出力からのすべての252タンパク質/ペプチドです。Flybase ID と遺伝子名が古いため、現在の Flybase 遺伝子 ID と遺伝子名を追加で提供します。 アップラギュレート これらは、bruno1-M2変異型IFMでアップレギュレートされたペルセウス出力からのすべての272タンパク質/ペプチドです。Flybase ID と遺伝子名が古いため、現在の Flybase 遺伝子 ID と遺伝子名を追加で提供します。 図5Bで赤色で強調表示されているサルコメアタンパク質は、上記のリストに存在します。サルコメアの一部と考えられる遺伝子のリストは、補足表1のタブの1つで利用可能である。 補足表2:bru M2変異体対ブルM2変異体における分発性タンパク質およびタンパク質アイソフォームを同定する1d成人からのプロテオーム質量分析データ全体の表。ワイルドタイプ IFM。