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Genetics

Dissecção de músculos de vôo de Drosophila melanogaster para abordagens Omics

Published: October 17, 2019
doi:
10.3791/60309
, , ,
1Biomedical Center, Department of Physiological Chemistry,Ludwig-Maximilians-University Munich, 2Center for Integrated Protein Science Munich (CIPSM), Department of Chemistry,Ludwig-Maximilians-University Munich

Summary

O músculo de vôo de Drosophila é um modelo poderoso para estudar a regulação transcricional, splicing alternativo, metabolismo e mecanobiologia. Nós apresentamos um protocolo para a dissecção do músculo fluorescente-etiquetado do vôo das pupas vivos para gerar amostras altamente enriquecidas ideais para o proteômica e profundamente-arranjar em seqüência. Essas amostras podem oferecer importantes insights mecanísticos em diversos aspectos do desenvolvimento muscular.

Abstract

O músculo de vôo de Drosophila é um modelo poderoso para estudar diversos processos, como regulação transcricional, splicing alternativo, metabolismo e mecanobiologia, que influenciam o desenvolvimento muscular e a miofibrilogênese. Os dados Omics, como os gerados por espectrometria de massas ou sequenciamento profundo, podem fornecer importantes insights mecanísticos sobre esses processos biológicos. Para tais abordagens, é benéfico analisar amostras específicas do tecido para aumentar a seletividade e a especificidade das impressões digitais Ômicas. Aqui nós apresentamos um protocolo para a dissecção do músculo fluorescente-etiquetado do vôo das pupas vivos para gerar amostras altamente enriquecidas do músculo para aplicações dos Ômicas. Nós descrevemos primeiramente como dissecar os músculos do vôo em estágios pupal adiantados ( 48 h APF) ou os adultos, quando os músculos são distinguíveis um microscópio de dissecação. O protocolo de vídeo que acompanha vai fazer essas dissecções tecnicamente exigentes mais amplamente acessíveis para as comunidades de pesquisa muscular e Drosophila . Para aplicações do RNA, nós ensaio a quantidade e a qualidade do RNA que pode ser isolado em pontos diferentes do tempo e com aproximações diferentes. Nós mostramos mais que Bruno1 (Bru1) é necessário para um deslocamento temporal na cadeia pesada da miosina (MHC) que emenda, demonstrando que os músculos dissecados podem ser usados para mRNA-Seq, espectrometria maciça, e reacção em cadeia reversa do polymerase da transcrição (RT-PCR) Aplicativos. Este protocolo de dissecção ajudará a promover análises Ômicas tecido-específicas e pode geralmente ser aplicado para estudar aspectos biológicos múltiplos do myogenesis.

Introduction

As tecnologias modernas do Ômicas fornecem introspecções importantes no desenvolvimento do músculo e nos mecanismos que subjacentes desordens humanas do músculo. Por exemplo, a análise dos dados de transcriptomicina combinada com a verificação genética e bioquímica em modelos animais revelou que a perda do fator de emenda RBM20 provoca cardiomiopatia dilatada devido à sua regulação de uma rede alvo de mais de 30 sarcômeros genes previamente associados à doença cardíaca, incluindo Titina1,2,3.

Em um segundo exemplo, os estudos da cultura de pilha, dos modelos animais, e dos pacientes humanos mostraram que a distrofia Myotonic está causada por um rompimento no Regulamento do RNA devido ao sequestro de muscleblind (mbnl) e do upregulation de CELF1,4,5. A dinâmica interregulatória e temporal entre MBNL e CELF1 (também chamada de CUGBP1 ou Bruno-like 2) ajuda a explicar os padrões persistentes de splicing embrionário em pacientes com distrofia miotônica. Além disso, a grande rede de alvos mal regulamentados ajuda a explicar a natureza complexa da doença4,6,7,8. A maioria desses estudos utiliza abordagens Ômicas em organismos modelo genético para compreender os mecanismos subjacentes à doença muscular humana. Além disso, destacam a importância da primeira compreensão da expressão gênica específica temporal e tecidual, modificação protéica e padrões metabólicos no músculo saudável para compreender as alterações no músculo doente ou no envelhecimento.

A Drosophila melanogaster é outro organismo modelo genético bem estabelecido. A estrutura do sarcômero, bem como componentes individuais sarcômeros são altamente conservados de moscas para vertebrados4,9,10, e os músculos de vôo indireto (ifms) tornaram-se um modelo poderoso para estudar múltiplos aspectos do desenvolvimento muscular11,12. Primeiramente, os músculos do vôo fibrilar são funcionalmente e morfològica distintos dos músculos tubulares do corpo11,13, permitindo a investigação de mecanismos de desenvolvimento específicos do músculo-tipo. Fatores de transcrição incluindo spalt Major (Salm)14, extradenticle (Exd) e homothorax (HTH)15 foram identificados como reguladores do destino fibrilar. Adicionalmente, a jusante de Salm, o CELF1 homólogo Bruno1 (Bru1, aret) dirige um programa de emenda fibrillar-específico16,17.

Em segundo lugar, o ifms é um modelo importante para a compreensão do processo de miogênese, da fusão mioblástica e do apego formação à miofibrilogênese e à maturação do sarcômero9,18,19. Em terceiro lugar, a genética da Drosophila permite a investigação de contribuições por proteínas individuais, domínios proteicos e isoformas proteicos para a formação, função e propriedades biofísicas do sarcômero20,21,22 ,23. Por fim, foram desenvolvidos modelos IFM para o estudo de múltiplos distúrbios musculares humanos, como a distrofia miotônica, miopatias miofibrilares, distúrbios degenerativos musculares, actinopatias, etc.24,25,26 ,27, e forneceram importantes insights sobre mecanismos de doenças e terapias potenciais28,29,30. Assim, a Drosophila é um modelo útil para abordar muitas questões abertas no campo da miogênese, incluindo mecanismos de transcrição específica do músculo-tipo, emenda e regulação da cromatina, bem como ao papel do metabolismo no desenvolvimento muscular. A aplicação de tecnologias Ômicas modernas, em particular em combinação com a grande variedade de genética, bioquímico e os ensaios biológicos da pilha disponíveis em Drosophila, tem o potencial para avançar dramàtica a compreensão do músculo desenvolvimento, envelhecimento e doença.

Ifms são os músculos os maiores na mosca, medindo quase 1 milímetro através do comprimento inteiro do tórax nos adultos31,32. No entanto, este pequeno tamanho gera o desafio de obter amostra suficiente para aplicar tecnologias Ômicas na Drosophila de uma forma específica do tipo tissue. Além disso, os IFMs fazem parte da musculatura adulta que é formada durante os estágios pupais. Mioblasts fundem-se para formar miotubos, que se unem aos tendões em torno de 24 h após a formação de pupário (APF) e passam por uma etapa de compactação necessária para iniciar a miofibrilogênese em torno de 30 h APF (Figura 1a-D)18,33, 34.

As miofibras, em seguida, crescem para abranger todo o comprimento do tórax, com miofibrilas submetidas a uma fase de crescimento inicial focada na adição de sarcômero até cerca de 48 h APF e, em seguida, transição para uma fase de maturação, em que os sarcômeros crescem em comprimento e largura e são remodelado para estabelecer estiramento-ativação por 72 h APF (Figura 1a-D)32,35. O início da maturação da fibra é pelo menos parcialmente controlado por Salm e E2F32,36,37, e isoformas IFM-específicas múltiplas da proteína de sarcômero cujo o splicing é controlado por Bru1 é incorporado durante este fase16,17. Maduro voa Eclose de 90 – 100 h APF. Isto significa que para estudar o desenvolvimento muscular, IFM tem de ser isolado com quantidade suficiente, qualidade e pureza de vários temporais pupal para facilitar a análise usando abordagens Ômicas.

Diversos protocolos para a dissecção de IFM foram publicados. Enquanto esses protocolos funcionam bem para suas aplicações pretendidas, nenhum é ideal para abordagens Ômicas. Os protocolos que preservam a morfologia de IFM para a imunofluorescência dos IFMs19pupal e adultos, isolam fibras de IFM para a avaliação mecânica31, ou utilizam a microdissecção do IFM pupal dos Cryosections38 são demasiado especializados e tempo e trabalho intensivo para obter razoavelmente quantidades suficientes de tecido IFM para aplicações Ômicas. Outros protocolos foram desenvolvidos para a dissecção rápida de IFM especificamente adulto38,39, assim não são aplicáveis aos estágios pupal, e usam os bufferes que não são ideais ou podem ser incompatíveis com, por exemplo, isolação do RNA. Assim, há uma necessidade de desenvolver novas abordagens para isolar o IFM pupal para aplicações de bioquímica ou Ômicas.

Aqui nós apresentamos um protocolo para a dissecção de IFM durante estágios do pupal que tem sido usado com sucesso para a análise de mRNA-Seq de 16 h APF através dos estágios adultos16,32. O protocolo emprega um rótulo de proteína verde fluorescente (GFP) para identificar IFMs em todas as fases do desenvolvimento pupal e adulto, permitindo a dissecção ao vivo um microscópio de dissecação fluorescente. A aproximação é menos labor-intensiva, com uma taxa de transferência mais elevada do que protocolos existentes da dissecção de IFM. Isso permite a rápida isolação e criopreservação de amostras, gerando material suficiente após várias rodadas de dissecção para abordagens Ômicas, bem como para a reacção em cadeia de transcrição reversa padrão (RT-PCR) ou western blotting.

Nós apresentamos o protocolo em duas porções, demonstrando como dissecar ràpida IFMs ambos antes de 48 h APF (durante o Metamorphosis adiantado, quando os acessórios de IFM são mais ténues) e após 48 h APF (quando a planta do corpo do pupal e os anexos de IFM são bem definidos). Nós demonstramos que nós podemos isolar o RNA da alta qualidade dos ifms dissecados em todos os temporais e apresentar dados em aproximações diferentes ao isolamento do RNA e à transcrição reversa. Por fim, demonstramos a aplicação do protocolo de dissecção a mRNA-Seq, espectrometria de massas e RT-PCR usando o homólogo CELF1 Bruno1 como exemplo. Nós mostramos o misexpression de isoformas da proteína do sarcômero em dados do proteômica do mutante Bruno1 IFM e examinamos a regulação Bruno1 do evento da tala do C-terminal da corrente pesada de myosin (MHC). Esses resultados ilustram como os dados omônicos podem proporcionar uma compreensão mais profunda dos fenômenos biológicos, complementando experimentos genéticos e bioquímicos.

Protocol

1. encenando as pupas Aumentar as moscas do genótipo desejado em frascos (Figura 1E). Ou fazer uma nova aleta do estoque de dissecção ou definir uma cruz com pelo menos 20 fêmeas moscas virgens. Manter garrafas até que as moscas começam a pupate. Colete pré-pupas com um pincel umedtado e transfira para o papel de filtro molhado em uma placa de Petri de 60 mm (Figura 1F). Sexo as pupas, coletando o gênero apropriado para o experimento (Figura 1G). Os machos são identificados pela presença de testículos, que aparecem como bolas translúcidas na pupa de outra forma opaca. Rotule a placa de Petri com a hora, a data e o genótipo, depois a idade das pupas até o estágio desejado (Figura 1H).Nota: Manter cruzes/estoques e pupas da idade em uma incubadora temperatura-controlada (isto é, 25 ° c ou 27 ° c para cruzes de RNAi, como a atividade aumentada de Gal4 em umas temperaturas mais elevadas aumenta a eficiência do Knock-down40). Assegure-se de que a humidade seja suficientemente alta para que as pupas não se secam ao envelhecer vários dias. 2. IFM dissecção antes 48 h APF Monte o equipamento necessário, incluindo dois #5 fórceps grau biologia, uma pipeta, pontas de pipeta, gelo seco, e (para amostras de RNA) reagente de isolamento (ver tabela de materiais). Além disso, Chill preto dissecando pratos (ver tabela de materiais), 1x fosfato tampão salina (PBS) buffer, e 1,5 ml tubos de microcentrífuga no gelo. Usando um pincel molhado, transfira pupas encenadas para um prato de dissecação preto preenchido cerca de dois terços com frio 1X PBS (Figura 2a, B). Mude para um microscópio de dissecação fluorescente.Nota: Use quantas pupas como pode ser dissecado dentro de uma janela de tempo de 30 min. Dependendo da experiência, isso varia de 3 – 15 pupas. Veja métodos suplementares para a discussão de alternativas aos pratos de dissecação pretos. Usando #5 fórceps, empurre uma das pupas para o fundo de um prato de dissecação preto e ajuste o zoom do microscópio e foco para ver claramente a pupa (Figura 2C). Segure o anterior da pupa com um fórceps (Figura 2D), em seguida, pique as pupas com uma única ponta do outro fórceps ligeiramente fora do centro no abdômen, logo atrás do tórax. Isto prende a pupa no lugar e impede que os IFMs movam no abdômen (Figura 2e).Nota: Comece cronometrar o comprimento da dissecção deste ponto, assim que a integridade do pupal for interrompida. Use um comprimento definido de dissecção (por exemplo 20 – 30 min) para minimizar a morte muscular e alterações transcriptomicas e proteômicas associadas. Dissecar o maior número de moscas possível neste período de tempo. Usando o primeiro fórceps, retire a metade anterior do caso pupal (Figura 2F). Use o mesmo fórceps para beliscar as pupas expostas logo atrás do tórax, e separar o abdômen do tórax (Figura 2G). Utilizando o fórceps, aperte suavemente a parte anterior do tórax (por < 35 h APF) ou abra o tórax para expor os IFMs fluorescentamente rotulados (Figura 2h). O IFMs desaparecerá facilmente da epiderme, pois os anexos tendinosos nos tempos iniciais são frágeis. Descarte a carcaça restante usando fórceps para empurrá-lo para o lado oposto do prato. Repetindo as etapas 2.3 – 2.7, dissecar pupas adicionais. Colete as fibras IFM com fórceps e organize-as em uma pilha na parte inferior do prato de dissecação preto (Figura 2I, J). Retire todos os detritos empurrando-o para fora do campo de visão usando fórceps.Nota: Com a prática, as pontas do fórceps podem ser trazidas na proximidade próxima sem tocar-se. Esta técnica pode ser usada para agarrar frouxamente IFMs sem destruí-los. Os métodos alternativos incluem delicadamente empurrando ou levantando o IFMs com uma única ponta ou fórceps completamente fechado, ou tomando algum tecido gordo ou outro com o IFM e removendo a gordura como descrito na etapa 2,10. Controle de qualidade da amostra de músculo IFM, utilizando o fórceps para remover os músculos não IFM, gordura, cutícula, etc. da amostra (Figura 2K, L).Nota: Com Mef2-Gal4, IFM é rotulado mais fortemente do que outros tipos musculares em tempos iniciais (Figura 2k, k ‘), permitindo a remoção de músculo de salto e músculos larvares com base na intensidade de fluorescência e forma muscular. A gordura e o tecido da cutícula parecem diferentes e não são rotulados por uma etiqueta de fluorescência específica do músculo (Figura 2k, k ‘). Consulte a seção de discussão para outras linhas Gal4 que rotulam IFM. Usando uma ponta cortada da pipeta, transfira a pilha de IFMs em um tubo do microcentrifugador de 1,5 mL enchido com 250 μL de 1x refrigerado PBS (Figura 2M-O). Prossiga imediatamente para a seção 4.Nota: As amostras de IFM podem ser perdidas simplesmente aderindo ao lado da ponta da pipeta. O amortecedor de pipetagem acima e para baixo diversas vezes antes de coletar ifms pode fazer pontas padrão menos pegajosas, e as pontas siliconized ou com (PFA) (veja a tabela dos materiais) com umas mais baixas tensões de superfície podem ajudar a impedir a perda da amostra. 3. dissecção IFM após 48 h APF Monte o equipamento necessário que inclui dois #5 fórceps da classe da biologia, tesouras finas, corrediças de vidro padrão do microscópio, fita da dobro-vara, pipeta, pontas da pipeta, gelo seco, e (para aplicações do RNA) reagente da isolação (veja a tabela dos materiais). Chill o 1X PBS e tubos de microcentrífuga no gelo. Usando um pincel levemente molhado, transfira as pupas encenadas para uma faixa de fita adesiva dupla face montada em uma lâmina de microscópio (Figura 3a). Coloc as pupas em uma linha orientada na mesma orientação (ventral para baixo e anterior para a parte inferior da corrediça).Nota: Tenha cuidado para não usar muita água no pincel ou filtro, ou as pupas não vai ficar bem. Se as pupas não furar, seque-os pela primeira transferência para um filtro seco ou papel tissue. Monte como pupas muitos como pode ser dissecado dentro de uma janela de tempo de 30 min, idealmente ~ 10 pupas. Retire a pupa do caso pupal. Use fórceps para provocar os pedaços e abrir o caso pupal acima das espiráculos anteriores (Figura 3B). Deslize suavemente um par de fórceps dorsalmente em direção ao posterior, cortando o caso pupal como o movimento fórceps (Figura 3B ‘). Tenha cuidado para não romper a pupa subjacente. Libere a pupa do caso aberto e transfira-a imediatamente a uma gota de 1X PBS em uma segunda corrediça do microscópio (Figura 3B “, C). Repita as etapas 3,3 e 3,4 para todas as pupas na linha e, em seguida, defina o slide de fita dupla vara de lado. Usando a tesoura fina, corte o abdômen da pupa longe do tórax e empurre-o para uma pilha separada (Figura 3d, d ‘). Repita para as pupas restantes.Nota: Comece cronometrar o comprimento da dissecção com etapa 3,6, assim que a integridade do pupal for interrompida. Dissecar o maior número possível de moscas em 20 – 30 min para evitar a morte celular e alterações transcriptomicas e proteômicas associadas. Quando dissecando 1 d adultos ou > 90 h pupas, muitas vezes é conveniente para etapas posteriores para remover adicionalmente a cabeça com a tesoura fina. Usando um papel tissue, retire a maioria do 1X PBS (geralmente nublado com gordura suspensa), bem como a pilha de algúmens (Figura 3E). Adicionar uma gota de fresco, refrigerado 1X PBS para os restantes thoraxes. Use a tesoura para cortar o tórax ao meio (Figura 3f, f ‘) cortando da cabeça para baixo o eixo longitudinal do corpo em um único movimento. Alternativamente, se a cabeça foi removida, primeiro insira a tesoura onde a cabeça foi anexada e corte a metade superior do tórax longitudinalmente entre o IFMs. Em seguida, corte o lado ventral do tórax com um segundo corte na mesma orientação. Repita as etapas 3,7 e 3,8 para que todas as pupas sejam dissecadas, gerando uma pilha de hemisections do tórax perto do centro da corrediça. Assegure-se de que há bastante refrigerado 1X PBS no slide para que as hemisections não secar.Nota: Após 48 h APF, os IFMs são grandes bastante ser visíveis um microscópio de dissecação padrão ao olho treinado. Neste ponto do protocolo, os músculos com uma etiqueta fluorescente podem ser movidos para um espaço de dissecação fluorescente para auxiliar na identificação de IFM ou para fins de treinamento, mas isso não é necessário. Dissecar o IFMs fora do tórax. Isolar um dos hemisections usando o fórceps #5 (Figura 3G, H). Insira suavemente as pontas de um fórceps acima e abaixo do meio do IFMs (Figura 3G ‘, H ‘). Enquanto segurando o primeiro fórceps ainda, use tesouras finas para cortar uma extremidade do IFM longe da cutícula e tendões. Em seguida, corte a outra extremidade do IFM livre da cutícula (Figura 3G ‘ ‘, H ‘ ‘).Nota: Dependendo da orientação do tórax após o primeiro corte IFM, é útil girar o tórax 180 ° para que o segundo corte IFM seja mais fácil de executar. Retire o pacote IFM do tórax com fórceps (Figura 3G ‘ ‘ ‘, H ‘ ‘ ‘), transferindo-o para a borda da bolha PBS para usar a tensão da água para segurá-la no lugar (Figura 3I). Empurre a carcaça para o lado oposto do slide. Repita para as hemisections restantes do tórax, gerando uma coleção de IFMs dissecados.Nota: Se o IFMs não permanecer em uma pilha pura, remova algum do 1X PBS com um tecido. Tenha cuidado para não deixar todos os PBS evaporarem, e garantir que os ifms dissecados e hemitórax permanecem cobertos por tampão. Após a dissecação de todos os IFMs, execute rapidamente um controle de qualidade no músculo dissecado. Usando #5 pinça, remover qualquer músculo de salto ou fragmentos de cutícula que podem ter encontrado o seu caminho para a amostra (Figura 3J-K ‘ ‘).Nota: O músculo do salto parece diferente de IFM. Se dissecando Mef2-Gal4 rotulado músculo fluorescência, o músculo de salto tem uma fluorescência mais fraca e uma forma e textura diferentes. a luz normal, parece quase translúcido, enquanto o IFMs são um opaco, amarelo leitoso (Figura 3j-j ‘ ‘, K). Usando a tensão da água, Capture (mas não Squish) os IFMs dissecados entre um par de fórceps (Figura 3L). Transfira o IFMs para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL pré-preenchido com 250 μL de 1X PBS refrigerado (Figura 3M). Prossiga imediatamente com a secção 4.Nota: Quando as pontas do fórceps são trazidas na proximidade de se e levantado fora de uma solução do amortecedor, a tensão da água faz com que uma bolha do amortecedor seja capturada entre as pontas do fórceps. Se IFMs também estão presentes nesta bolha, eles podem ser levantados para fora da solução e facilmente transferidos para outro receptáculo cheio de buffer. É importante espremer o fórceps para trazer as pontas perto de uma outra sem tocar-se, para evitar macerar o tecido capturado na bolha do amortecedor. 4. pellet e preservar a amostra IFM Pellet o IFMs por centrifugação do tubo de microcentrífuga de 1,5 mL por 3 – 5 min a 2.000 x g em uma centrífuga de mesa (Figura 4a, B). Retire o tampão utilizando uma ponteira de pipeta (Figura 4C). Para aplicações de RNA, ressuscite o pellet IFM em 50 – 100 μL do buffer de isolamento de RNA desejado (ver tabela de materiais, Figura 4D). Caso contrário, avance para o passo 4,4.Nota: IFMs pode ser seco-congelado após a etapa 4,2 para preparações da espectrometria maciça ou isolação do RNA com jogos comerciais (veja resultados representativos). Para aplicações de RNA, melhores resultados são obtidos por imediatamente ressuscitava e congelando a pelota IFM em buffer de isolamento. Congelar a amostra em gelo seco ou congelamento de pressão em nitrogênio líquido (Figura 4E). Armazene em-80 ° c até que apronte para etapas subseqüentes na preparação da amostra para a análise a jusante.Nota: Após a criopreservação, as amostras podem ser armazenadas por vários meses antes do processamento para investigação a jusante.

Representative Results

Os protocolos de dissecção apresentados acima são úteis para gerar amostras enriquecidas com IFM de 16 h após a formação de pupário (APF) até o estágio adulto. As amostras dissecadas do músculo do vôo podem ser usadas para aplicações múltiplas, e têm sido aplicadas até agora com sucesso para RT-PCR4,17, RNA-Seq16,32, microplaqueta36,37, ocidental blotting14,41 e experimentos de espectrometria de massas (ver abaixo). Para ajudar os usuários potenciais que dissecam para aplicações RNA-baseadas, nós apresentamos primeiramente nossos resultados que destacam considerações importantes especificamente para a isolação do RNA de IFMs. Para demonstrar de forma mais ampla a utilidade dos nossos protocolos de dissecção, ilustramos algumas das aplicações possíveis – Omics utilizando os nossos dados sobre a proteína de ligação de RNA Bruno1. Protocolo de dissecção IFM produz RNA de alta qualidade É importante determinar o número de moscas a serem dissecadas com antecedência, pois estima-se que a codificação do mRNA constitua apenas 1 – 5% do RNA total42. Obteve-se, em média, 24 ± 9 ng de RNA total por mosca de IFM dissecado de adultos de 1 d (Figura 4F e Figura suplementar 1a), com rendimentos tipicamente crescentes com experiência. Este rendimento de RNA total por mosca é relativamente constante, oscilando em torno de 25 ng para IFM dissecado em 16 h APF, 24 h APF, 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF e 90 h APF (Figura 4F e Figura suplementar 1B, D, e). Estas observações igualmente refletem todo o RNA isolado da gordura contaminando, do tendão, da traqueia ou dos outros tipos da pilha, que podem ser mais elevados nas amostras isoladas dos timepoints mais adiantados. Assim, obteve-se > 1 μg de RNA total de IFM de 50 moscas e tipicamente dissecar IFM de 100 − 150 moscas para gerar > 3 μg de RNA total para amostras de RNA-Seq. O método de isolamento de RNA afeta a quantidade e a qualidade do RNA recuperado, e incentivamos os usuários a validar sua abordagem de isolamento. Por exemplo, enquanto o isolamento usando o método 1 produz em média 1143 ± 465 ng de RNA total de IFM de 50 1 d moscas adultas, isolamento com vários kits comerciais rende em qualquer lugar de 186 ± 8 ng para 1261 ± 355 ng de RNA total (Figura 4G e Figura suplementar 1C). O RNA isolado dos kits comerciais é geralmente de boa qualidade (Figura 4H e Figura suplementar 1F), mas baixas recuperações sugerem que o RNA pode não ser eficientemente eluída das colunas. A integridade do RNA também pode ser comprometida pelo uso de um kit como feito no método 2 (Figura 4H, segundo gráfico), provavelmente devido à constituição de buffer e aos tratamentos térmicos, levando a uma fragmentação severa que pode impactar experimentos a jusante. Também é importante observar a técnica adequada de RNase livre ao isolar e manusear amostras de RNA. Embora os ciclos do congelar-descongelamento e uma incubação da temperatura de quarto de 4 h não impactem dramaticamente perfis da integridade do RNA, mesmo as pequenas quantidades de RNase conduzem à degradação rápida do RNA (Figura 4mim e métodos suplementares). Os usuários ainda são incentivados a trabalhar em gelo e limitar congelar-descongelamento para evitar a hidrólise de RNA e fragmentação. Isso não foi detectado aqui, mas impedindo a contaminação por RNase usando pontas de filtro e buffers tratados com DEPC é absolutamente essencial. A eficiência da transcrição reversa também impacta o sucesso de aplicações a jusante. Obtivemos resultados confiáveis com dois dos três kits de RT comerciais que testamos, que amplificam as bandas de RT-PCR fortes para o gene ribossômico rp49 (Figura 4J). No entanto, o RT Kit #2 pode ser mais sensível para a detecção de transcrições baixas expressas, pois obtivemos bandas mais fortes para a proteína de ligação de RNA bru1 para todas as três repetições biológicas (Figura 4J). Tomados junto, estes resultados ilustram que o RNA de alta qualidade pode ser isolado dos IFMs dissecados com este procedimento. IFMs dissecados produzem dados de mRNA-Seq e proteômica de alta qualidade Usando IFM dissecado de acordo com o protocolo acima em 30 h APF, 72 h APF e de 1 d adulto voa, nós mostramos previamente que a proteína RNA-obrigatória e o CELF1-homologue Bruno1 (Bru1, apreensão, aret) controla uma via de emenda IFM-específica a jusante do fator de transcrição Spalt Major (Salm)16. Ifms de mutantes nulos, bem como moscas com músculo-específico bruno1 RNAi (bru1-ir) exibir defeitos de crescimento sarcômero, desregulação da atividade da miosina e, finalmente,hipercontração e perda de fibras musculares16,17 . Abaixo nós Demonstramos a utilidade de ifms dissecados para a espectrometria maciça inteira do proteoma e mostramos que diversas das mudanças da expressão que nós observamos no nível do RNA são igualmente evidentes no nível da proteína. Nós destacamos mais um evento específico do desenvolvimento da tala no MHC que foi encontrado para ser regulado por Bruno1, ilustrando que mRNA-Seq e RT-PCR dos ifms dissecados podem ser usados para demonstrar a regulação de eventos alternativos da tala. Dependendo da qualidade e profundidade da biblioteca, os dados de mRNA-Seq podem ser analisados no nível das unidades genéticas (média de contagens de leitura sobre todos os exons de um gene), exões individuais ou junções de junção. os dados de mRNA-Seq de bru1-ir ifms comparado ao tipo selvagem mostram mudanças fracas na expressão na unidade de gene nível16 (Figura 5a). Em 72 h APF, há já uma tendência para genes do sarcômero tais como a proteína do Lim do músculo em 60A [Mlp60A], o actina 57B [Act57B], a proteína músculo-específica 300 kDa [Msp300], ou stretchin-mlck [strn-mlck]) que são importantes para que o desenvolvimento apropriado do músculo seja regulado em músculo bru1-ir (Figura 5A e tabela suplementar 1). Entretanto, nós mostramos previamente que no nível de exons individuais, há um downregulation muito mais forte de isoformas específicos16do gene do sarcômero, sugerindo a função principal de Bruno1 é controlar a emenda alternativa (tabela suplementar 1 ). Utilizando espectrometria de massas de proteoma total em IFMs dissecados, pode-se demonstrar regulação semelhante no nível protéico (Figura 5B e tabela suplementar 2). Dos 1.895 grupos peptídicos detectados, 524 (28%) deles são desregulamentados em Bru1m2 mutante IFM em 1 d adultos (tabela suplementar 2). O downregulation da proteína de strn-Mlck e de Mlp60A é observado igualmente, combinando observações a nível do Transcript em nossos dados de mRNA-Seq. Apesar do número limitado de peptídeos de banco de dados que mapeiam para isoformas de proteínas específicas (ver métodos suplementares para detalhes de análise), para proteínas sarcômeros tropomyosin 1 (TM1), confirmada (up/TNT), MHC, Bent (BT/projectin) e Paramyosin (PRM) nós observar o upregulation dos peptídeos de uma isoforma e downregulation de outro (Figura 5B), confirmando nossas observações precedentes da regulação similar no nível16do RNA. Isto demonstra que os ifms dissecados são úteis para ambos os mRNA-Seq e aplicações do proteômica. Como um exemplo mais adicional de como os dados do Ômicas podem complementar aproximações tradicionais para realçar e estender a introspecção biológica, nós escolhemos centrar-se sobre a emenda no C-Terminus de MHC. Uma linha previamente caracterizada da armadilha da proteína chamada weeP26 é inserida no intron final de MHC43,44 (veja métodos suplementares para a posição exata). weeP26 contem um Acceptor forte da tala e é incorporado em presumivelmente todos os transcritos MHC (Figura 5C). No entanto, a proteína GFP rotulada em IFM é incorporada em dois “pontos” em ambos os lados da M-line, enquanto no músculo da perna, ele incorpora uniformemente através da linha M e fracamente através dos filamentos grossos (Figura 5e). Orfanos e pardal mostraram estes “pontos” no formulário de IFM devido a um interruptor desenvolvente do isoforma de MHC : o isoforma de MHC expressado antes de 48 h APF é GFP-Etiquetado como as inserções do exon weeP26 no frame lido aberto, quando o MHC isoforma expressa após 48 h APF é unlabeled, porque o exon weeP26 é incluído a jusante do Codon da parada no 3 ‘-utr44. Nossos dados de mRNA-Seq nos permitiram caracterizar a expressão de isoforma do C-terminal MHC em maior detalhe. Quando duas terminações diferentes de MHC foram relatadas43,44, nossos dados de mRNA-Seq e a anotação atual do FlyBase (FB2019_02) sugerem que há realmente três eventos alternativos possíveis da tala no MHC C-Terminus (exon 34-35, 34-36, ou 34-37) (Figura 5C), que é confirmado por RT-PCR (Figura 5D). weeP26 O GFP é inserido no intron entre exon 36 e 37; assim, como as isoformas exon 34-35 e exon 34-36 contêm codões de parada, a GFP só pode ser traduzida na isoforma exon 34-37 (resultando em exon 34-GFP-37). Nós pudemos também ver a regulação temporal e espacial de todas as isoformas MHC . No IFM, observamos um comutador isoforma de MHC de exon 34-37 a exon 34-35 entre 30 h APF e 48 h APF (Figura 5c, D, F) a 27 ° c, embora isso ainda não seja visível por imunofluorescência a 48 h APF (Figura 5e). As pernas já expressam uma mistura de exon 34-37 e exon 34-35 a 30 h APF, e por 72 h APF expressam todas as três isoformas MHC (Figura 5D, F). O músculo de salto adulto (TDT) também expressa todas as três isoformas de MHC (Figura 5F), sugerindo que isso geralmente é verdadeiro para os músculos somáticos tubulares. Assim, nossos dados de mRNA-Seq permitem a extensão de resultados precedentes estreitando o período de tempo para o interruptor do isoforma de MHC em IFM e caracterizando o uso do isoforma de MHC em músculos tubulares. O Regulamento do isoforma de MHC em Salm e em bru1 mutante IFM foi examinado então. Em ambos os casos, vimos desregulação da weeP26. Os ifms mutantes de Salm não conseguem terminar o interruptor desenvolvente na expressão do isoforma de MHC e nos testes padrões de emenda do pé do fenocópia em umas fases mais atrasadas, incluindo o ganho do evento de exon 34-36 (Figura 5F). Isto concorda com resultados precedentes que a perda de Salm conduz a uma transformação próximo-completa do Fate de IFM ao músculo tubular16. Bru1-ir e Bru1 mutante IFM, semelhante ao Salm-/- IFM, retém o exon 34-37 Splice evento através de estágios adultos (Figura 5E, F), resultando em um padrão de rotulagem weeP26 GFP assemelhando-se ao músculo da perna, Mas não ganha o evento exon 34-36. Isto sugere que o Bruno1 é necessário em IFM para pelo menos parcialmente controlar o interruptor desenvolvente no splicing alternativo de MHC , mas indica que os fatores de emenda adicionais são regulados igualmente no Salm-/-contexto. Além disso, este exemplo ilustra como os dados de RT-PCR e de mRNA-Seq do IFM dissecado podem ser valiosos em ganhar uma compreensão mais profunda de mecanismos de emenda desenvolventes e de defeitos morfológicos observados. Figura 1: desenvolvimento de IFM e estadiamento de pupas. (A) esquema de desenvolvimento IFM em 24 h apf, 32 h apf, 48 h apf, 72 h APF, e 1 d adultos mostrando compactação de músculos de vôo (verde) em ~ 32 h APF e subsequente crescimento de fibras para encher o tórax. Os tendões estão em cinza escuro. (B) imagens confocais de ifms fixas de dissecções abertas do livro (24 h, 32 h, 48 h)19 ou hemisections do tórax (72 h, 1 dia) manchadas para o actina (Phalloidin do RHODAMINE, magenta) e GFP (verde). (C, D) Imagens de fluorescência de GFP em pupas ao vivo ilustrando a morfologia intacta de IFM da linha de dissecção de mosca no plano dorsal (C) ou lateral (D). Asteriscos marca IFM localização. (E) para se preparar para as dissecções, os estoques de mosca devem ser invertidos ou cruzes ajustados 3 – 4 dias adiantado. (F) as prepupas são selecionadas por sua cor branca (pontas de seta amarelas) e isoladas usando um pincel umedtado (f ‘, f ‘ ‘). (G) as prepupas devem ser sexadas para separar as fêmeas de machos com base na presença de testículos que aparecem como bolas translúcidas posteriormente localizadas (asteriscos amarelos). (H) As pupas são envelhecidas no papel de filtro molhado em pratos de 60 milímetros. Barras de escala = 100 μm (B), 1 cm (C, D, E, H), 1 mm (F, F ‘ ‘, G). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: dissecção de ifms antes de 48 h APF. (A) adição do tampão de 1X PBS a um prato de dissecação preto com uma pipeta de transferência. (B) transferência de pupas encenadas usando um pincel. (C) um microscópio de dissecação fluorescente para visualizar GFP, empurrão delicado do pupa à parte inferior de um prato de dissecação usando o fórceps #5 (esboçado no cinza). O “X” em um círculo denota o movimento na imagem. (D, E) Agarrando das pupas anteriormente (D), então picando das pupas apenas atrás do tórax (E). Traço em um círculo denota nenhum movimento. (F, G) Puxando com o fórceps anterior (seta) para remover o caso pupal (F), a seguir a remoção do abdômen (G). (H) repetição de C-G para várias pupa. As linhas pontilhadas amarelas são numeradas, indicando pupas que contribuem. (I, J) Uso do fórceps (I) para isolar IFMs do tecido circunvizinho (J). O ponto em um círculo denota o movimento fora da página. (K, L) Remoção de contaminantes, incluindo gordura e salto (TDT) músculos (K) para gerar uma amostra de IFM limpo (L). TDT tem menor expressão de GFP e uma forma diferente de fibras IFM (K ‘). (M, N, O) Uso de uma ponta cortada da pipeta (M) para coletar IFMs dissecados (N) e sua transferência a um tubo do microcentrifugador (O). Barras de escala = 1 cm (A, B, M, O), 1 mm (C-G), 500 μm (H-L, N). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: dissecção de ifms após 48 h APF. (A) alinhamento de pupas em fita dupla vara. (B) remoção de pupas da caixa de Marias abrindo anteriormente (b), cortando o caso dorsalmente (b ‘), e levantando a pupa (b ‘ ‘). Os símbolos do círculo representaram o mesmo que a Figura 2. (C) transferência de pupas para tampão. (D) remoção do abdômen cortando com tesouras (setas dobro amarelas) e separação dos tórax (d ‘). (E, F) Adição de tampão limpo (E), em seguida, corte de toraxes ao meio longitudinalmente (f, f ‘). (G, H) As dissecções podem ser executadas a luz branca (G) ou a fluorescência para visualizar o GFP (H); corte do IFMs em um lado (G ‘), então o outro lado (G ‘ ‘); levantamento do tórax com pinça (delineada em cinza) (G ‘ ‘ ‘). (I, J, K) Coleta de IFMs em tampão (I) e remoção de contaminando o cabo do nervo ventral (VNC), intestino, e músculo de salto (TDT) (J) para gerar uma amostra de IFM limpa (K). TDT tem menor expressão de GFP e uma forma diferente de fibras IFM (J ‘ ‘, K ‘). (L, M) Uso de fórceps para transferir IFMs (L) para um tubo de microcentrífuga (M). Barras de escala = 1 cm (A, E, M), 1 mm (B-D ‘, F-L). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: preservação IFM e detalhes de isolamento de RNA. (A) as ifms são peletizadas por centrifugação durante 5 min a 2000 x g. (B) pelota de IFM (seta) e pelota a fluorescência (b ‘). (C) remoção de todo o tampão com uma ponta da pipeta. (D) para a extração do RNA, ressuspensão da pelota no amortecedor da isolação. Esta etapa pode ser ignorada para secar-congelar IFMs dissecados. E) congelamento da amostra em azoto líquido ou em gelo seco e armazenagem a-80 ° c. Barras de escala = 10 cm (A), 1 mm (B, B ‘), 1 cm (C, D, E). (F) nanogramas (NG) de RNA total de IFM dissecado obtidos por mosca a 16 h APF, 24 h APF, 30 h apf, 48 h apf, 72 h apf, 90 h APF e 1 d adulto. Barras de erro = SD. (G) RNA total isolado de IFM dissecado de 50 1 d moscas adultas usando diferentes métodos de extração. Barras de erro = SD. (H) traços representativos à integridade do RNA do ensaio após métodos diferentes da extração. As bandas ribossômicas correm logo abaixo de 2000 nucleotídeos (NT) e a faixa de marcador a 25 NT. vestígios adicionais disponíveis na Figura 1 suplementar. (I) traços representativos de uma amostra de RNA recém-isolada (parte superior), uma amostra congelada-descongelada 25x em gelo seco (segundo lote), uma amostra deixada por 4 h no banco (terceira parcela), e uma amostra tratada com RNase a (parcela inferior). Anote a degradação completa do RNA após A adição do gel de RNase A. (J) RT-PCR dos jogos como etiquetados para bru1 e rp49. A intensidade relativa da banda bru1 normalizada contra rp49 é plotada abaixo. Barras de erro = SEM (teste tnão pareado, p = 0, 119). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: aplicação de dissecções IFM para investigar a função Bruno1 em splicing alternativo. (A) lote de vulcão de mRNA-Seq dados (unidade genética) de ifms dissecados em 72 h APF. Os genes que são significativamente regulados diferencialmente entre bru1-ir e o tipo selvagem IFM (padj < 0, 5, ABS (log2FC) > 1.5) são mostrados em genes azuis, e não-significativos no cinza. As proteínas do sarcomere são destacadas em vermelho, e os genes seletos são etiquetados. (B) lote de vulcão de resultados de espectrometria de massa proteoma inteira de 1 d adultos ifms. As proteínas significativamente diferentes entre os mutantes de Brum2e o tipo selvagem (FDR < 0, 5) são mostradas em proteínas azuis, não significativas no cinza. As proteínas sarcomeric são destacadas em vermelho. Peptídeos correspondentes a genes em (A) são rotulados em vermelho. Conjuntos de peptídeos mapeados para diferentes isoformas da mesma proteína são rotulados na mesma cor. C) esquema do c-Terminus de MHC ilustrando isoformas de transcrição distintas e localização de inserção da armadilha genética weeP26 (ver métodos suplementares para ponto de inserção). Os primers RT-PCR são denotados como linhas pretas acima das transcrições. Contagens de leitura por kilobase por milhão bases (rpkm) de mRNA-Seq são mostradas para ifms dissecados do tipo selvagem em 30 h APF (alaranjado) e 72 h APF (vermelho), de bru1-ir (azul) e de Salm-/- (ciano) em 72 h APF e do pé inteiro (verde) em 72 h APF . (D) RT-PCR com primers contra MHC mostrando o comutador isoforma em IFM entre 30 h APF e timepoints posteriores. O exon 34-35 Splice evento só é fracamente observado em Brum3mutante IFM ou na perna adulta. (E) imagens confocais de localização de weeP26 GFP em sarcôlios do tipo tipo selvagem IFM em 48 h APF e 90 h APF em comparação com 90 h de músculo APF do pé. Barras de escala = 1 μm. (F) quantificação da junção da tala de dados de mRNA-Seq para genótipos e temporais como rotulados. As leituras da junção são apresentadas como a relação de um evento específico da tala (exon 34 a 35 no cinza, 34 a 36 no roxo, e 34 a 37 no verde) ao número total eventos que compartilham do exon 34 o doador da tala. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura complementar 1: (a, B, C) o RNA produz a partir de amostras do mesmo genótipo dissecadas pelo mesmo pesquisador na mesma semana. Depois que todas as amostras foram dissecadas, o RNA foi isolado e medido no mesmo dia. (A) nanogramas (NG) de RNA total obtido a partir de dissecções IFM por mosca adulta de 1 d. Barras de erro = SEM. (B) RNA total obtido de IFM dissecado por mosca a 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF e 1 d adulto. (C) RNA total isolado de IFM dissecado a partir de 50 1 d moscas adultas utilizando diferentes métodos de extração. (D) concentrações totais de RNA por mosca de pernas dissecadas, músculo de salto (TDT) e IFM. Mais RNA é obtido dos IFMs maiores. Barras de erro = SD. (E) concentrações totais de RNA por mosca de IFM dissecadas a partir de controles em comparação com RNAi ou amostras mutantes em 30 h APF, 72 h APF e 1 d adulto. Para mutantes, w1118 foi usado como controle tipo selvagem. Os dados mutantes são compilados de bru1-ir, Salm-/- e outro mutante de proteína de ligação de RNA. Note que para estas manipulações, os rendimentos do RNA são diminuídos em 1 d adulto devido à atrofia e à perda do músculo, assim que mais moscas precisam de ser dissecadas para obter quantidades suficientes para aproximações do Ômicas. Barras de erros = SD. (F) traços adicionais mostrando a integridade do RNA para os métodos de isolamento de RNA mostrados na Figura 4G e na Figura suplementar 1C. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Métodos suplementares: Uma descrição detalhada dos métodos e reagentes utilizados em todo o texto e, em particular, para gerar os dados mostrados na Figura 1a-D, Figura 4F-K, Figura 5, tabela suplementar 1, e Tabela complementar 2. Estes dados motivam o protocolo da dissecção e demonstram sua utilidade para o isolamento do RNA, o mRNA-Seq, o RT-PCR, e o Proteomics. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo. Relacionados com a Figura 5 e os parágrafos associados no texto principal Nome da Tabulação Resumo dos dados Proteínas do sarcomere Lista de genes de sarcômero de Spletter et al. elife 2018; Aqui listamos o FBgn atual e o nome do gene. Gene SP units_DESeq2_72h Usando dados de Spletter et al. EMBO Rep 2015, nós olhamos especificamente para os genes sarcômeros nos dados mRNA-Seq em 72 h APF. Isto é da análise DESeq2 que detecta a expressão diferencial no nível de unidade do gene entre o controle (Mef2-Gal4, UAS-GFM-GMA cruzado a w1118) e Mef2-Gal4, UAS-GFM-GMA x Bruno1-IR. As linhas destacadas em amarelo são sinalizado para cima ou para baixo genes regulados (acima/abaixo de um limiar de log2FC = ABS (1.5)). Esses dados são a sobreposição de ponto vermelho na figura 5A. Para cada gene sarcômero, fornecemos informações de identificador, o log2FC de DESeq2, valor de P e valor de P ajustado, bem como DESeq2 contagens de expressão normalizada. SP exon_DEXSeq_72h Usando dados de spletter et al. embo Rep 2015, nós olhamos especificamente para sarcômero gene exon uso nos dados mRNA-Seq em 72 h APF. Isto é da análise de DEXSeq que detecta o uso diferencial do exon entre o controle (Mef2-Gal4, UAS-GFM-GMA cruzado a w1118) e Mef2-Gal4, UAS-GFM-GMA x Bruno1-IR. Linhas destacadas em amarelo são bem acima ou abaixo de exons regulados (acima/abaixo de um limiar de log2FC = ABS (1.5)). Nós fornecemos informações de identificador de exon e Gene, o log2FC de DEXSeq, valor de P e valor de P ajustado, bem como uma lista de transcrições associadas. Por favor, note que muitos genes mostram a regulação de um ou mais exons na análise DEXSeq, muitas vezes com altos valores de log2FC e baixo valor P/ajustar os valores de P, enquanto uma lista limitada de genes mostra alterações em 72 h APF. Isso suporta um forte efeito da perda de Bruno sobre a regulação da emenda alternativa. Tabela suplementar 1: tabela de 72 h APF mRNA-Seq dados para proteínas sarcômero identificando genes diferencialmente expressos (via DESeq2) e exons (via dexseq) em bru1-ir versustipo selvagem ifms. Relacionados com a figura 5B e os parágrafos associados no texto principal Nome da Tabulação Resumo dos dados Saída de Perseus Esta é uma planilha de dados processados que apresenta os dados de espectrometria de massa usados para gerar a figura 5B. As amostras de IFM são de 1 d controle adulto (w1118) e mutantes (bruno1-m2) moscas. Colunas importantes são os valores de intensidade transformada para cada uma das 4 repetições para cada amostra, a estatística do teste t e a significância, os peptídeos e os nomes dos genes correspondentes e os IDs do FlyBase. O signifance foi calculado usando as configurações padrão em Perseus (FDR <. 05). Existem 1859 proteínas/peptídeos detectados, dos quais 524 (28%) são significativamente diferentes entre as amostras. Ativador Estas são todas as 252 proteínas/peptídeos da saída Perseus que são regulados em bruno1-m2 mutante IFM. Como os IDs do FlyBase e os nomes dos genes estão desatualizados, também fornecemos o ID do gene FlyBase e o nome do gene atuais. Upregulated Estas são todas as 272 proteínas/peptídeos da saída Perseus que são upregulated em bruno1-m2 mutante IFM. Como os IDs do FlyBase e os nomes dos genes estão desatualizados, também fornecemos o ID do gene FlyBase e o nome do gene atuais. Por favor, note que as proteínas do sarcômero destacadas em vermelho na figura 5B estão presentes nas listas acima. A lista de genes considerados parte do sarcômero está disponível em uma das abas na tabela complementar 1. Tabela suplementar 2: tabela de dados inteiros da massa-espectrometria do proteoma do adulto de 1 d que identifica as proteínas diferencialmente expressas e as isoformas da proteína no mutante de Brum2 contra tipo selvagem ifms.

Discussion

Neste protocolo, nós apresentamos a técnica básica para dissecar o ifms de Drosophila dos puppae adiantados e do tarde-estágio para a isolação a jusante da proteína, do ADN, do RNA ou das outras macromoléculas. O protocolo pode ser facilmente adaptado para dissecar IFM de moscas adultas. Demonstramos a utilidade de nosso protocolo de dissecção para aplicações de mRNA-Seq, proteômica e RT-PCR. Com a melhoria contínua das tecnologias de Ômicas para permitir a análise das amostras com menos material de partida e umas mais baixas concentrações da entrada, estas dissecções tornar-se-ão provavelmente valiosas para muitas aplicações adicionais. Como ifms são um modelo estabelecido para miopatias humanas4,24 e desenvolvimento específico do músculo-tipo9,12, nós imaginamos, por exemplo, Metabolomics IFM-enriquecidos, investigações da conformação da cromatina via 3C ou 4C, avaliação da rede de emenda através das interações do grampo ou phospho-Proteomics do myofibrillogenesis.

É importante considerar que estas dissecções produzem uma amostra enriquecida para IFM em vez de uma amostra pura de IFM. Isto é inevitável devido à inervação do neurônio do motor, aos acessórios do tendão e à invasão tracheal de fibras de músculo. A análise de Bioinformática pode ser usada para identificar genes ou proteínas IFM enriquecidas, mas são necessárias novas experiências para demonstrar que elas são de fato IFM-específicas. A pureza da amostra pode ser ensaiada usando marcadores específicos do tecido publicados, como a listra45 (tendão), Act79B,4,44 (músculo tubular), Act88F15 (IFM) ou Syb46 (específico neuronal). Pode ser possível usar esses marcadores para normalizar conjuntos de dados para o conteúdo específico do IFM, mas os usuários são advertidos de que as alterações temporais na expressão de genes usados para normalização, por exemplo, genes ou tubulina específicos de IFM, podem viés tal abordagem.

Os métodos de rotulagem específicos do tecido genetically codificados, por exemplo EC-etiquetar47,48 ou PABP-etiquetando49,50 para isolar o RNA foram desenvolvidos nos últimos anos, que podem ajudar a obter verdadeiramente amostra de RNA específica do tecido. No entanto, a marcação CE requer alimentação constante de moscas47 e, portanto, não é aplicável durante os estágios pupais. A sensibilidade e a completude dos transcriptoma rotulados por PABP podem ter limitações51. As aproximações de FACS para isolar fibras de músculo individuais são complicadas pelo tamanho grande e pela natureza sincicial de ifms. INTACT52,as aproximações do estilo53 podem ser aplicadas para isolar subcellular-compartimentos específicos de ifms, que podem provar útil para isolar populações puras de núcleos ou de mitocôndria de IFM. As dissecções manuais são ainda o padrão atual para obter o tecido intacto de IFM para a maioria de aplicações downstream.

A qualidade da amostra depende de várias etapas críticas no processo de dissecção. As dissecções são tecnicamente exigentes, com velocidade de dissecção e pureza da amostra aumentando com a experiência. A dissecação por curtos períodos de tempo (20 – 30 min) em tampão refrigerado sem detergente e o congelamento imediato ajuda a preservar a integridade da amostra, como já foi observado anteriormente para o isolamento do tendão do rato54. IFMs pode com sucesso secar-congelado após ter removido todo o amortecedor da pelota, mas especificamente para o isolamento do RNA, as amostras de congelação no amortecedor da isolação tendem a produzir melhores resultados. Os ifms de até 20 dissecções separadas são combinados antes do isolamento do RNA ou da proteína, permitindo escalar acima e coletar bastante material, mesmo dos temporais adiantados ou dos mutantes16,32, para a análise a jusante.

Para aplicações de RNA, o passo mais crítico pode ser o isolamento do próprio RNA. O isolamento de guanidínio tiocianato-fenol-clorofórmio (método 1 acima) supera a maioria dos kits comerciais testados e, como observado anteriormente, é consideravelmente menos caro55. A variabilidade observada nos rendimentos de isolamento de RNA com kits comerciais está de acordo com as observações anteriores56,57. Nós adicionamos mais o glicogênio durante a precipitação do isopropanol para ajudar a recuperar todo o RNA. Além do rendimento de RNA, é importante verificar a integridade do RNA para garantir que a amostra não tenha sido fragmentada ou degradado durante os processos de dissecção e isolamento. Também é essencial para o trabalho RNase-livre. Por último, a escolha do RT-kit pode impactar a sensibilidade do processo de transcrição reversa. Embora não muitas vezes discutido em detalhes, todos estes pontos influenciam a qualidade da amostra IFM e os dados obtidos a partir de aplicações a jusante.

Diversas modificações importantes ajustaram o protocolo aparte dos protocolos existentes da dissecção de IFM. Embora um protocolo detalhado da dissecção para a imunofluorescência de IFM exista19, este protocolo apresenta uma aproximação diferente às dissecções pupal que permite uma isolação mais rápida do tecido de IFM. Isso permite a coleta de grandes quantidades de tecido IFM (relativamente falando) com tempos de dissecção limitados para evitar alterações de proteoma ou transcriptoma. Outros protocolos descrevem a dissecção do adulto IFM para visualizar a mancha de GFP em miofibrilas individuais39 ou para a mancha de músculos larval da corpo-parede58, mas não endereçam a dissecção em estágios do pupal ou para a isolação do RNA ou da proteína. Esta aproximação é igualmente distinta do protocolo existente para a microdissecção de ifms pupal dos Cryosections38, que pode gerar uma amostra mais mais puro de IFM mas é mais labor intensivo e produz menos material. Em comparação com outros protocolos adultos rápidos da dissecção de IFM38,39, ifms são isolados no amortecedor de PBS sem detergente para limitar a indução do esforço e outras mudanças principais da expressão.

O avanço chave neste protocolo é a inclusão de um repórter ao vivo, fluorescente, permitindo o isolamento das IFMs em estágios iniciais pupais. Nós usamos Standardly Mef2-GAL459 dirigindo ou UAS-CD8:: GFP ou UAS-GFP:: GMA60. Isto permite a rotulagem diferencial de IFM (os músculos do vôo são etiquetados mais fortemente e diferentemente dados forma do que outros músculos do pupal) assim como o desempenho de GAL4-UAS-baseou manipulações, por exemplo salvamento ou experiências de RNAi. Também é possível combinar Mef2-GAL4 com Tub-GAL80TS para evitar a letalidade precoce associada ao RNAI ou com o UAS-Dcr2 para aumentar a eficiência de RNAi40.

Há outros drivers GAL4 ou GFP-Lines disponíveis que variam em especificidade do tipo músculo, padrão de expressão temporal e força do driver19,61 que podem ser usados em vez de Mef2-GAL4. Por exemplo, Act88F-GAL4 é expressado pela primeira vez em torno de 24 h APF, portanto, ele não pode ser usado para timepoints anteriores; Entretanto, etiqueta fortemente IFM e pode ser útil evitar o Lethality adiantado RNAi-associado. Ele-GFP ou Act88F-GFP etiqueta IFM, novamente com restrições temporais, mas eles evitam GAL4 dependência de expressão de marcador e pode ser útil em combinação com um fundo mutante de interesse. As listas de outras linhas de marcador possíveis estão disponíveis19. Deve-se também notar que o uso de transgenes e o sistema GAL4/UAS pode causar artefatos de expressão gênica, por isso é importante usar controles apropriados, por exemplo, a linha de motorista cruzou para a estirpe de fundo do tipo selvagem, de modo que esses artefatos são presumivelmente o mesmo em todas as amostras.

Com o vídeo que o acompanha, este protocolo detalhado visa tornar a dissecção pupal IFM mais acessível e promover o uso de abordagens Ômicas para estudar o desenvolvimento muscular. Acoplando o poder da genética de Drosophila e da biologia de pilha com os ensaios da bioquímica e do Ômicas acessíveis através de IFM dissecado tem o potencial para avançar a compreensão mecanicista da miogênese e da função do músculo. Estudos futuros que ligam as observações de nível de sistema do transcriptoma e do Regulamento do proteoma às saídas metabólicas e funcionais fornecerão uma compreensão mais profunda do músculo-tipo desenvolvimento específico e da patogénese de desordens do músculo.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Andreas Ladurner e Frank schnorrer pelo apoio generoso. Agradecemos a Sandra Esser pela excelente assistência técnica e Akanksha Roy para gerar os dados de espectrometria de massas. Nós reconhecemos os centros de estoque de Bloomington e de Viena para fornecer moscas. Agradecemos ao Core Facility BioImaging para obter ajuda com a imagem confocal e o Zentrallabor für Proteinanalytik para análise de amostras de espectrometria de massas, tanto no centro biomédico LMU (Martinsried, DE). Nosso trabalho foi apoiado pelo Deutsche Forschungs gemeinschaft (MLS, SP 1662/3-1), o centro de ciência integrada de proteínas de Munique (CIPSM) na Ludwig-Maximilians-University München (MLS), o Frederich-Bauer Stiftung (MLS), e o International Max Escola de pesquisa de Planck (EN).

Materials

5x High Fidelity (HF) buffer Thermo Fisher F518L
60 mm culture dishes Sigma-Aldrich Z643084-600EA Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented
black dissecting dish (glass) Augusta Laborbedarf 42021010 Lymphbecken, black glass, 4×4 cm
black silicon dissecting dishes: activated charcoal powder Sigma-Aldrich C9157 Also available from most pharmacies
black silicon dissecting dishes: Sylgard 184 Sigma-Aldrich 761036 Dishes are made by mixing the Sylgard (~50g) with activated charcoal powder (200 mg) and curing it in Petri dishes (~4 60 mm dishes).
blue pestle Sigma-Aldrich Z359947-100EA Any pellet pestle that can sterilized, also can be used with a motor-driven grinder
cell phone camera, Samsung Galaxy S9 Samsung SM-G960F/DS used for photos not taken under a microscope
chloroform PanReac AppliChem A3691,0500
confocal microscope, Leica SP8X upright confocal Leica www.leica-microsystems.com
confocal microscope, Zeiss LSM 780 inverted confocal Zeiss www.zeiss.com
double stick tape Scotch/3M 3M ID 70005108587 Double-sided tape, available at most office supply handlers
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 x 0.02 mm tip
EtOH (100%, RNase free) Sigma-Aldrich 32205-M
fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera Leica www.leica-microsystems.com
fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0 Leica www.leica-microsystems.com
fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC Leica www.leica-microsystems.com
Fly: Bru1[M2] Fly stock; This paper
Fly: Bru1[M3] Fly stock; This paper
Fly: Mef2-GAL4 Bloomington Stock Center BDSC:27390 Fly stock
Fly: salm[1] Bloomington Stock Center 3274 Fly stock
Fly: salm[FRT] Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018
Fly: UAS-Bru1IR Vienna Drosophila Research Center GD41568 Fly stock, RNAi hairpin
Fly: UAS-GFP::Gma Bloomington Stock Center BDSC:31776 Fly stock
Fly: UAS-mCD8a::GFP Bloomington Stock Center BDSC:5130 Fly stock
Fly: w[1118] Bloomington Stock Center 3605 Fly stock
Fly: weeP26 Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003
GFP detection reagent, GFP-Booster ChromoTek gba488-100
glycogen Invitrogen 10814-010
image processing software, Photoshop CS6 Adobe www.adobe.com
isopropanol Sigma-Aldrich I9516-25ML 2-propanol
Method 1 (RNA isolation): TRIzol Life Technologies 15596018 Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution
Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit Invitrogen AM1907 TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA
Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit Zymo Research R2070S RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer.
Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134 We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues.
Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System Promega Z6110 We applied the protocol for ‘Purification of RNA from Fibrous Tissues’.
Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit New England Biolabs T2010G We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 μL of RNA Protection Reagent.
Microcentrifuge tubes Thermo Fisher AM12400 RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL
Microscope slides Thermo Fisher 12342108 Standard slides, uncharged, 1 mm
microtome blades PFM Medical 207500003 C35 feather 80mm
Monarch DNase I New England Biolabs T2004-21
Monarch DNase I Reaction Buffer New England Biolabs T2005-21
normal goat serum Thermo Fisher 16210072
OneTaq Polymerase New England Biolabs M0480X
Paintbrush Marabu 1910000000 Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
PBS buffer (1x) Sigma-Aldrich P4417 Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4
PFA PureTip Pipette Tips Elemental Scientific ES-7000-0101 Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice
Phusion High Fidelity Polymerase Thermo Fisher F-530XL
Pipette tips Sigma-Aldrich P5161 Universal 200 mL pipette tips
Preomics iST 8x Kit Preomics P.O.00001 peptide preparation kit for mass spectrometry
Q Exactive mass spectrometer Thermo Fisher 725500 mass spectrometry was performed at the Protein Analysis Unit of the LMU Biomedical Center
Qubit RNA Assay Kit Life Technologies Q32855
rhodamine-phalloidin Invitrogen, Molecular Probes 10063052
RNA concentration Approach 1 & RNA integrity traces, Bioanalyzer Agilent Technologies G2939BA
RNA concentration Approach 2, Nanodrop Thermo Fisher ND-2000
RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer Invitrogen Q33238
RNA Pico Chips Agilent Technologies 5067-1513
RNase A Promega A7937
RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich D5758 DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase.
RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit Invitrogen 18080-044 reverse transcription kit
RT Kit #2: LunaScript New England Biolabs E3010S reverse transcription kit
RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit Qiagen 205410 reverse transcription kit
slide mounting buffer, Vectashield Vector Laboratories H-1200 containing DAPI
statistical software: GraphPad Prism GraphPad Prism www.graphpad.com
statistical software: Microscoft Excel Microsoft Purchased as part of the bundle: Office Home & Student 2019
Table-top centrifuge Eppendorf 5405000760 Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent
tissue/ Kimwipes Sigma-Aldrich Z188956 Standard tissue wipes
Transfer pipette Sigma-Aldrich Z350796 Plastic pipette
Triton-X100 Sigma-Aldrich T9284-500ML
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-00 3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm
Whatman paper Sigma-Aldrich 1004-070 Filter paper circles, Grade 4, 70 mm
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Kao, S., Nikonova, E., Ravichandran, K., Spletter, M. L. Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches. J. Vis. Exp. (152), e60309, doi:10.3791/60309 (2019).
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