JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

Рассечение Drosophila меланогастер полет мышц для омичи подходы

Published: October 17, 2019
doi:
10.3791/60309
, , ,
1Biomedical Center, Department of Physiological Chemistry,Ludwig-Maximilians-University Munich, 2Center for Integrated Protein Science Munich (CIPSM), Department of Chemistry,Ludwig-Maximilians-University Munich

Summary

Дрозофила полет мышцы является мощной моделью для изучения транскрипционной регуляции, альтернативные сращивания, метаболизм, и механобиологии. Мы представляем протокол для вскрытия флуоресцентных маркировки полет ноймышци от живых кусков для создания высокообогащенных образцов идеально подходит для протеомики и глубокого секвенирования. Эти образцы могут предложить важные механистические идеи в различных аспектах развития мышц.

Abstract

Дрозофила полет мышцявляется мощная модель для изучения различных процессов, таких как транскрипционная регуляция, альтернативное сращивание, обмен веществ, и механобиологии, которые все влияют на развитие мышц и миофибрилломанис. Данные омичей, такие как данные, генерируемые масс-спектрометрией или глубоким секвенированием, могут обеспечить важное механистическое понимание этих биологических процессов. Для таких подходов полезно анализировать образцы тканей для повышения как избирательности, так и специфичности отпечатков пальцев омичков. Здесь мы представляем протокол для вскрытия флуоресцентных помечены полет мышцы от живых кукулак для создания высокообогащенных образцов мышц для омики приложений. Сначала мы описываем, как вскрыть летные мышцы на ранних стадиях pupal (lt;48 h после формирования пупария »APF), когда мышцы различимы по маркировке зеленого флуоресцентного белка (GFP). Затем мы описываем, как вскрыть мышцы от поздних кукол (No gt;48 h APF) или взрослых, когда мышцы различимы под рассекающим микроскопом. Сопровождающий видеопротокол сделает эти технически требовательные вскрытия более доступными для исследований мышц и дрозофилы. Для РНК-приложений мы просаим количество и качество РНК, которые могут быть изолированы в разные моменты времени и с различными подходами. Мы также показываем, что Bruno1 (Bru1) необходим для временного сдвига в миозиновой тяжелой цепи(Mhc)сращивания, демонстрируя, что расчлененные мышцы могут быть использованы для мРНК-Сек, масс-спектрометрии и обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (RT-PCR) Приложений. Этот протокол вскрытия поможет продвинуть анализ ыткоми и может быть в целом применен для изучения многочисленных биологических аспектов миогенеза.

Introduction

Современные омичи технологии обеспечивают важное понимание развития мышц и механизмов, лежащих в основе нарушений мышц человека. Например, анализ данных транскриптомики в сочетании с генетической и биохимической проверкой в моделях животных показал, что потеря сращивания фактора RBM20 вызывает расширенную кардиомиопатию из-за его регулирования целевой сети из более чем 30 саркоме гены, ранее связанные с сердечными заболеваниями, в том числе титин1,2,3.

Во втором примере, исследования, проведенные из клеточной культуры, животных моделей и пациентов с людьми показали, что миотоническая дистрофия вызвана нарушением регулирования РНК из-за секвестра Muscleblind (MBNL) и upregulation CELF14,5. Кросс-регуляторная и височная динамика между MBNL и CELF1 (также называемый CUGBP1 или Bruno-Like 2) помогает объяснить стойкие эмбриональные модели сращивания у пациентов с миотонической дистрофией. Кроме того, большая сеть нерегулируемых целей помогает объяснить сложный характер заболевания4,6,7,8. Большинство таких исследований используют омичные подходы в генетических модельных организмах, чтобы понять механизмы, лежащие в основе заболеваний мышц человека. Кроме того, они подчеркивают важность первого понимания временного и тканевого типа специфической экспрессии генов, изменения белка и метаболических моделей в здоровых мышцах, чтобы понять изменения в больной или стареющей мышце.

Drosophila melanogaster является еще одной устоявшейся генетической модели организма. Структура саркомера, а также отдельных компонентов саркомера высоко сохраняется от мух до позвоночных4,9,10,и косвенные мышцы полета (IFMs) стали мощной моделью для изучения несколько аспектов развития мышц11,12. Во-первых, фибриллярные летные мышцы функционально и морфологически отличаются от трубчатых мышц тела11,13,что позволяет исследовать мышцы типа конкретных механизмов развития. Транскрипция факторов, включая Spalt основных (Salm)14, Extradenticle (Exd), и Homothorax (Hth)15 были определены как фибриллярной судьбы регуляторов. Кроме того, вниз по течению Салм, CELF1 омолог Бруно1 (Bru1, Aret) направляет фибриллярной конкретной программы сращивания16,17.

Во-вторых, IFMs являются важной моделью для понимания процесса миогенеза себя, от миобласт слияния и миотубины привязанности к миофибрилломанез и саркомере созревания9,18,19. В-третьих, drosophila генетики позволяет исследования вклада отдельных белков, белковых доменов и изоформ овеков для формирования саркомера, функции, и биофизические свойства20,21,22 ,23. Наконец, ifM модели были разработаны для изучения нескольких человеческих мышечных расстройств, таких как миотоническая дистрофия, миофибриллярные миопатии, мышечные дегенеративные расстройства, актинопатии и т.д.24,25,26 ,27, и предоставили важные идеи в механизмах болезни и потенциальных методов лечения28,29,30. Таким образом, Drosophila является полезной моделью для решения многих открытых вопросов в области миогенеза, в том числе механизмов мышечного типа конкретной транскрипции, сплайсинга и регулирования хроматина, а также роли метаболизма в развитии мышц. Применение современных омичных технологий, в частности в сочетании с широким спектром генетических, биохимических и клеточных биологических анализов, доступных в Дрозофиле,имеет потенциал для резкого продвижения понимания мышц развития, старения и болезней.

IFMs являются крупнейшими мышцы в лету, охватывающих почти 1 мм по всей длине грудной клетки у взрослых31,32. Тем не менее, этот небольшой размер создает проблему получения достаточного количества выборки для применения технологий омики в Drosophila в ткани типа конкретного образом. Кроме того, IFMs являются частью взрослой мускулатуры, которая образуется во время pupal этапов. Myoblasts предохранитель для формирования миотубевей, которые прикрепляются к сухожилиям около 24 ч после формирования пупария (APF) и проходят шаг уплотнения, необходимые для инициирования миофибрилломаниса около 30 ч APF(Рисунок 1A-D)18,33, 34.

Myofibers затем расти, чтобы охватить всю длину грудной клетки, с myofibrils проходит начальную фазу роста сосредоточены на саркомере дополнение примерно до 48 ч APF, а затем переход к фазе созревания, в котором саркомеры растут в длину и ширину и реконструирован, чтобы установить растяжение активации на 72 ч APF(рисунок 1A-D)32,35. Начало созревания волокна, по крайней мере частично контролируется Salm и E2F32,36,37, и несколько IFM-специфических изоформ овеющего белка саркомера, сплайсинг которых контролируется Bru1, включены в течение этого фаза16,17. Зрелые мухи пристыковываются от 90-100 ч APF. Это означает, что для изучения развития мышц, IFM должна быть изолирована с достаточным количеством, качеством и чистотой от нескольких кваранских точек времени для облегчения анализа с использованием подходов омичей.

Было опубликовано несколько протоколов для вскрытия МФМ. Хотя эти протоколы хорошо работают для их предполагаемых приложений, ни один из них не подходит для омиков подходов. Протоколы, которые сохраняют морфологию IFM для иммунофлюоресценции pupal и взрослых IFMs19, изолировать волокна IFM для механической оценки31, или использовать микрорассеификацию pupal IFM из криосекций38 слишком специализированы и времени и трудоемкие для разумного получения достаточного количества ткани IFM для применения омики. Другие протоколы были разработаны для быстрого вскрытия специально для взрослых IFM38,39, таким образом, не применяются к pupal этапов, и использовать буферы, которые не являются идеальными или могут быть несовместимы с, например, изоляции РНК. Таким образом, необходимо разработать новые подходы к изоляции pupal IFM для биохимии или омики приложений.

Здесь мы представляем протокол для вскрытия IFM во время pupal этапов, который был успешно использован для анализа мРНК-Seq от 16 ч APF через взрослых этапов16,32. Протокол использует зеленый флуоресцентный белок (GFP) этикетку для выявления IFMs на всех стадиях развития PUpal и взрослых, что позволяет живой вскрытия под флуоресцентным рассеивающим микроскопом. Этот подход менее трудоемкий, с более высокой пропускной емкостью, чем существующие протоколы вскрытия IFM. Это позволяет быстро йозолировать и криоконсервацию образцов, генерируя достаточно материала после нескольких раундов вскрытия для подходов омичей, а также для стандартной обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (RT-PCR) или западного промотирования.

Мы представляем протокол в двух частях, демонстрируя, как быстро вскрыть IFMs как до 48 ч APF (во время ранней метаморфозы, когда вложения IFM являются более разжитыми) и после 48 ч APF (когда pupal план тела и IFM вложения четко определены). Мы демонстрируем, что можем изолировать высококачественную РНК от вскрытых МФМ в любой момент времени и представить данные о различных подходах к изоляции РНК и обратной транскрипции. Наконец, мы демонстрируем применение протокола вскрытия к mRNA-Seq, масс-спектрометрии и RT-PCR с использованием гомолога CELF1 Bruno1 в качестве примера. Мы показываем непровержим саркомере белка изоформы в протеомики данных от Bruno1 мутант IFM и изучить Bruno1 регулирование C-терминал аспилк событие Myosin тяжелой цепи (Mhc). Эти результаты иллюстрируют, как данные омичи могут обеспечить более глубокое понимание биологических явлений, дополняя генетические и биохимические эксперименты.

Protocol

1. Постановка купаний Поднимите мухи желаемого генотипа в бутылках(рисунок 1E). Либо сделать свежий флип вскрытия акций или установить крест, по крайней мере 20 женщин девственных мух. Поддерживайте бутылки до тех пор, пока мухи не начнут осваиваться. Соберите pre-pupae с смачиваемым кистью и перенесите на смаченную фильтровальную бумагу в 60 мм чашку Петри(рисунок 1F). Секс куски, собирая соответствующий пол для эксперимента(Рисунок 1G). Самцы идентифицируются по наличию яичек, которые появляются как полупрозрачные шары в иначе непрозрачной куколке. Пометьте чашку Петри со временем, датой и генотипом, затем стемоните куколки до нужной стадии(рисунок 1H).ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание крестов / запасов и возраст кукол в контролируемых температурой инкубатора (т.е., 25 C или 27 C для РНК кресты, как увеличение активности Gal4 при более высоких температурах увеличивает нокдаун эффективность40). Убедитесь, что влажность достаточно высока, поэтому куски не высыхают при старении несколько дней. 2. Вскрытие IFM до 48 ч APF Соберите необходимое оборудование, включая два #5 щипцы биологического класса, пипетку, кончики пипетки, сухой лед и (для образцов РНК) изоляционный реагент (см. Таблица материалов). Кроме того, охладить черные рассекающие блюда (см. Таблица материалов),1x фосфат-буферный солен (PBS) буфер, и 1,5 мл микроцентрифуговых труб на льду. Используя смачиваемую кисть, перенесите пской на черное рассекающее блюдо, наполненное примерно двумя третями холодным 1x PBS(рисунок 2A,B). Перейдите к флуоресцентным рассекающим микроскопом.ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте столько кускатов, сколько можно пресечно в течение 30 минут. В зависимости от опыта, это колеблется от 3 до 15 кусков. Смотрите дополнительные методы для обсуждения альтернатив черным рассекающим блюдам. Используя #5 щипчу, нажмите один из куколки на дно черного рассекая блюдо и настроить микроскоп зум и сосредоточиться, чтобы четко видеть куколку (Рисунок 2C). Возьмитесь за переднюю часть куколки с помощью одного щипцы(рисунок 2D),затем ткнуть куколки с одним кончиком других щипцы немного вне центра в животе, сразу за грудной клетки. Это держит кукула на месте и предотвращает IFMs от перемещения в брюшной полости(Рисунок 2E).ПРИМЕЧАНИЕ: Начните время длина вскрытия с этой точки, как только pupal целостности нарушается. Используйте определенную длину вскрытия (например, 20-30 мин), чтобы свести к минимуму мышечную смерть и связанные с ними транскриптомические и протеомные изменения. Вскрыть как можно больше мух, как это возможно в этот период времени. Используя первые щипцов, удалите переднюю половину pupal случае(рисунок 2F). Используйте те же щипцвы, чтобы ущипнуть открытых куска сразу за грудной клетки, и отделить живот от грудной клетки(Рисунок 2G). Используя щипц, аккуратно сожмите переднюю часть грудной клетки (для lt;35 h APF) или рип открыть грудную клетку, чтобы разоблачить флуоресцентно помечены IFMs (Рисунок 2H). IFMs легко отделиться от эпидермиса, как сухожилия вложения в начале timepoints являются хрупкими. Откажитесь от оставшейся туши с помощью щипцов, чтобы подтолкнуть его к противоположной стороне блюда. Повторяющиеся шаги 2.3-2.7, вскрыть дополнительные куска. Соберите волокна IFM с щипками и организовать их в кучу в нижней части черного рассекая блюдо(Рисунок 2I,J). Удалите любой мусор, выталкивая его из поля зрения с помощью щипков.ПРИМЕЧАНИЕ: С практикой, щипчи советы могут быть приведены в непосредственной близости, не касаясь друг друга. Этот метод может быть использован для свободно захватить IFMs, не разрушая их. Альтернативные методы включают мягко едкие или подъемы IFMs с одним наконечником или полностью закрытыми щипцыми, или принимая некоторые жир или другие ткани с IFM и удаление жира, как описано в шаге 2.10. Контроль качества образца мышц IFM, используя щипцы для удаления мышц, не IFM мышц, жира, кутикулы и т.д. из образца(Рисунок 2K, L).ПРИМЕЧАНИЕ: С Mef2-Gal4, IFM помечена сильнее, чем другие типы мышц на ранних тайм-пойнтах(рисунок 2K,K’),что позволяет удаление мышц прыжка и личинок мышц на основе интенсивности флуоресценции и формы мышц. Ткани жира и кутикулы выглядят по-разному и не помечены мышечной флуоресценции этикетке(Рисунок 2K, K ‘). Смотрите раздел обсуждения для других строк Gal4, которые маркируют IFM. Используя обрезанный наконечник пипетки, перенесите кучу IFMs в микроцентрифугную трубку 1,5 мл, наполненную 250 злиц охлажденным 1x PBS(рисунок 2M-O). Немедленно приступай к разделу 4.ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы IFM могут быть утеряны, просто прилипая к стороне наконечника пипетки. Pipetting буфер вверх и вниз несколько раз, прежде чем собирать IFMs может сделать стандартные советы менее липким, и силиконовые или perfluoroalkoxy (PFA) советы (см. Таблица материалов) с более низкой поверхности напряженности может помочь предотвратить потерю образца. 3. Вскрытие IFM после 48 ч APF Соберите необходимое оборудование, включая два #5 биологических щипцы класса, тонкие ножницы, стандартные стеклянные слайды микроскопа, двухпалочная лента, пипетка, пипетка советы, сухой лед, и (для РНК приложений) изоляции реагента (см. Таблица материалов). Охладите 1x PBS и микроцентрифуговых труб на льду. Используя слегка смачиваемую кисть, перенесите плетнеки на полоску двусторонней липкой ленты, установленной на слайде микроскопа(рисунок 3А). Поместите кухондора в линию, ориентированную в той же ориентации (вентральный вниз и передний к нижней части слайда).ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не использовать слишком много воды на кисти или фильтра, или куколок не будет придерживаться хорошо. Если кудьки не прилипают, высушите их, сначала переведя на сухой фильтр или бумажную ткань. Маунт столько кускатов, как может быть вскрыты в течение 30 минут времени окна, в идеале 10 кусков. Удалите кугуизму из pupal случае. Используйте щипцы, чтобы дразнить друг от друга и открыть pupal случае выше передней spiracles(Рисунок 3B). Аккуратно сдвиньте пару щипцов dorsally к задней, резки pupal случае, как щипцы двигаться(Рисунок 3B’). Будьте осторожны, чтобы не разорвать основной кулачий. Освободите куколку от открытого корпуса и немедленно перенесите его на каплю 1x PBS на втором слайде микроскопа(рисунок 3B”, C). Повторите шаги 3.3 и 3.4 для всех кусков в линии, затем установите двойную ручку ленты слайд в сторону. Используя тонкие ножницы, вырезать живот куколки от грудной клетки и нажмите его в отдельную кучу(Рисунок 3D, D ‘). Повторите для остальных кусков.ПРИМЕЧАНИЕ: Начните время длина вскрытия с шагом 3.6, как только pupal целостность нарушается. Вскрыть как можно больше мух, как это возможно в 20-30 минут для предотвращения смерти клеток и связанных транскриптомических и протеомных изменений. При вскрытии 1 d взрослых или 90 h pupae, это часто удобно для последующих шагов, чтобы дополнительно удалить голову с тонкими ножницами. Используя бумагу для излучены, удалите большинство 1x PBS (как правило, облачно с взвешенным жиром), а также груду животов(рисунок 3E). Добавьте каплю свежего, охлажденный 1x PBS к остальным грудным клеткам. Используйте ножницы, чтобы сократить грудную клетку в два раза(Рисунок 3F,F’) путем резки от головы вниз оси продольного тела в одном движении. Кроме того, если голова была удалена, сначала вставьте ножницы, где голова была прикреплена и вырезать верхнюю половину грудной клетки продольно между IFMs. Затем вырежьте вентральную сторону грудной клетки вторым разрезом в той же ориентации. Повторите шаги 3.7 и 3.8 для того, чтобы все куколки были вскрыты, создавая кучу гемисекций грудной клетки вблизи центра слайда. Убедитесь, что есть достаточно охлажденных 1x PBS на слайде, так что гемисекции не высохнут.ПРИМЕЧАНИЕ: После 48 ч APF, IFMs достаточно велики, чтобы быть видимым под стандартным расчленяющим микроскопом к натренированному глазу. На данный момент в протоколе, мышцы с флуоресцентной этикеткой могут быть перемещены в флуоресцентный рассечение сферы для оказания помощи в идентификации IFM или для учебных целей, но это не является необходимым. Вскрыть IFMs из грудной клетки. Изолировать один из гемисекций с помощью #5 щипц(рисунок 3G,H). Аккуратно вставьте кончики одной щипцой выше и ниже середины IfMs(Рисунок 3G’,H’). Пока держа первые щипцы все еще, используйте тонкие ножницы для того чтобы отрезать один конец IFM далеко от кутикулы и сухожилий. Затем вырежьте другой конец IFM, свободный от кутикулы(рисунок 3G’,’H”’).ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от ориентации грудной клетки после первого разреза IFM полезно повернуть грудную клетку на 180 градусов, чтобы второй разрез IFM был легче выполнять. Удалите расслоение IFM из грудной клетки с щипками(Рисунок 3G”,’H”’), перенося его на край пузыря PBS, чтобы использовать напряжение воды, чтобы держать его на месте(Рисунок 3I). Нажмите тушу на противоположную сторону горки. Повторите для остальных гемисекций грудной клетки, создавая коллекцию вскрытых IfMs.ПРИМЕЧАНИЕ: Если IFMs не остаются в аккуратные кучу, удалить некоторые из 1x PBS с тканью. Будьте осторожны, чтобы не позволить всем PBS испаряться, и убедитесь, что вскрытые IFMs и гемиторерасы остаются покрыты буфером. После вскрытия всех IfMs, быстро выполнить контроль качества на вскрытую мышцу. Используя #5 щипцы, удалить любые мышцы прыжка или кутикулы фрагменты, которые, возможно, нашли свой путь в образец(Рисунок 3J-K’).ПРИМЕЧАНИЕ: Мышца прыжка отличается от IFM. Если вскрыть Mef2-Gal4 помечены мышцы при флуоресценции, прыгать мышцы слабее флуоресценции и другой формы и текстуры. При нормальном свете, он появляется почти полупрозрачный в то время как IFMs являются непрозрачными, молочно-желтый(Рисунок 3J-J’, K). Используя водное напряжение, захват (но не хлюпать) вскрытые IFMs между парой щипцы(рисунок 3L). Передача IFMs на 1,5 мл микроцентрифугтрубки предварительно заполнены с 250 л охлажденных 1x PBS(рисунок 3M). Немедленно приступай к разделу 4.ПРИМЕЧАНИЕ: Когда щипц советы приведены в непосредственной близости друг от друга и поднял из буфера решения, водное напряжение вызывает пузырь буфера, которые будут захвачены между щипками советы. Если IFM также присутствуют в этом пузыре, они могут быть сняты из раствора и легко переданы в другой буфер заполненный сосуд. Важно, чтобы сжать щипц, чтобы принести советы рядом друг с другом, не касаясь друг друга, чтобы избежать macerating ткани, захваченные в буферный пузырь. 4. Пеллет и сохранить образец IFM Пеллет иФМ центрифуги 1,5 мл микроцентрифуги в течение 3-5 мин при 2000 х г в центрифуге столешницы(рисунок 4A,B). Удалите буфер с помощью наконечника пипетки(рисунок 4C). Для РНК-приложений повторно приостанавливаете действие гранул IFM в 50-100 л желаемого буфера изоляции РНК (см. Таблица материалов, Рисунок 4D). В противном случае приступай к шагу 4.4.ПРИМЕЧАНИЕ: IfMs могут быть заморожены после шага 4.2 для подготовки масс-спектрометрии или изоляции РНК с коммерческими комплектами (см. репрезентативные результаты). Для РНК-приложений лучшие результаты получаются путем немедленной повторной приостановки и замораживания гранул IFM в изолированном буфере. Заморозить образец на сухом льду или оснастки заморозить в жидком азоте(Рисунок 4E). Храните при -80 градусах По Цельсию до готовности к последующим шагам в подготовке образца для анализа ниже по течению.ПРИМЕЧАНИЕ: После криоконсервации образцы могут храниться в течение нескольких месяцев перед обработкой для исследования ниже по течению.

Representative Results

Протоколы вскрытия, представленные выше, полезны для создания обогащенных ИФМ образцов от 16 ч после образования пупария (APF) до взрослой стадии. Расчлененные образцы летной мышцы могут быть использованы для нескольких приложений, и до сих пор успешно применяется для RT-PCR4,17, РНК-Seq16,32, CHIP36,37 ,Западный blotting14,41 и масс-эксперименты спектрометрии (см. ниже). Чтобы помочь потенциальным пользователям вскрывать приложения на основе РНК, мы сначала представляем наши результаты, подчеркивая важные соображения, специально для изоляции РНК от IFMs. Чтобы более широко продемонстрировать полезность наших протоколов вскрытия, мы затем иллюстрируем некоторые из возможных приложений, используя наши данные о РНК-связывающем белке Bruno1. Протокол вскрытия IFM дает высококачественную РНК Важно определить количество мух, которые будут вскрыты заранее, так как кодирование мРНК, по оценкам, составляет всего 1-5% от общего объема РНК42. Мы получили в среднем 24 и 9 нг от общего объема РНК на лету от IFM расчлененных от 1 d взрослых(Рисунок 4F и дополнительная рисунок 1A), с выходами, как правило, увеличивается с опытом. Эта доходность общей РНК на лету является относительно постоянной, колеблется около 25 нг для IFM расчлененные на 16 ч APF, 24 ч APF, 30 ч APF, 48 ч APF, 72 ч APF и 90 ч APF(Рисунок 4F и дополнительная цифра 1B, D , E). Эти наблюдения также отражают любую РНК, изолированную от загрязнения жира, сухожилия, трахеи или других типов клеток, которые могут быть выше в образцах, изолированных от более ранних временных точек. Таким образом, мы получили от IFM 1 мкг общей РНК от 50 мух и, как правило, вспаряем IFM от 100–150 мух, чтобы генерировать 3 мкг общей РНК для образцов РНК-Сек. Метод изоляции РНК влияет на количество и качество восстановленной РНК, и мы призываем пользователей проверить их подход к изоляции. Например, в то время как изоляция с использованием метода 1 производит в среднем 1143 и 465 нг общей РНК от IFM от 50 1 d взрослых мух, изоляция с различными коммерческими комплектами дает где-то от 186 – 8 нг до 1261 и 355 нг от общей РНК(Рисунок 4G и Дополнительная рисунок 1С). РНК изолированы от коммерческих комплектов, как правило, хорошего качества(Рисунок 4H и дополнительный рисунок 1F), но низкий восстановления свидетельствуют о том, что РНК не может быть эффективно eluted из столбцов. Целостность РНК также может быть скомпрометирована использованием комплекта, как это делается в методе 2(Рисунок 4H, второй участок), вероятно, из-за буферной конституции и тепловой обработки, что приводит к тяжелой фрагментации, которые могут повлиять вниз по течению экспериментов. Важно также соблюдать надлежащий метод Без RNase при изоляции и обработке образцов РНК. Хотя циклы замораживания-оттепели и инкубация температуры комнаты 4 h драматически не влияют на профили целостности RNA, даже небольшие количества RNase водят к быстрой деградации RNA(Рисунок 4I и Дополнительные методы). Пользователям по-прежнему рекомендуется работать на льду и ограничивать замораживание оттепели, чтобы предотвратить РНК гидролиз и фрагментацию. Это не было обнаружено здесь, но предотвращение загрязнения RNase с помощью фильтра советы и DEPC-обработанных буферов является абсолютно необходимым. Эффективность обратной транскрипции также влияет на успех приложений ниже по течению. Мы получили надежные результаты с двумя из трех коммерческих комплектов RT мы тестировали, которые оба усиливают сильные полосы RT-PCR для рибосомного гена rp49 (Рисунок 4J). Тем не менее, RT Kit #2 может быть более чувствительным для обнаружения низковыраженных стенограмм, как мы получили более сильные полосы для РНК-связывающего белка bru1 для всех трех биологических репликций (Рисунок 4J). Взятые вместе, эти результаты показывают, что высококачественная РНК может быть изолирована от IFMs, расчлененных с помощью этой процедуры. Расчлененные ИФМ производят высококачественные данные mRNA-Seq и протеомики Использование IFM расчлененные в соответствии с вышепротоколом на 30 ч APF, 72 ч APF и от 1 d взрослых мух, мы ранее показали, что РНК-связывающий белок и CELF1-гомомолуг Bruno1 (Bru1, Арест, Aret) контролирует IFM-специфический сращивание путь вниз по течению транскрипция фактор Spalt основных (Салм)16. IFMs от null мутантов, а также мух с мышцами конкретных bruno1 RNAi(bru1-IR) дисплей sarcomere дефекты роста, неправильное регулирование активности миозина и в конечном итоге гиперсжатие и потеря мышечных волокон16,17 . Ниже мы демонстрируем полезность вскрытых ИФМ для всей протеомной масс-спектрометрии и показываем, что некоторые из изменений экспрессии, которые мы наблюдали на уровне РНК, также очевидны на уровне белка. Мы также подчеркиваем конкретные развития сращивания событие в Mhc, который был признан регулируется Bruno1, иллюстрируя, что мРНК-Сек и RT-PCR из вскрытых IFMs могут быть использованы для демонстрации регулирования альтернативных событий сращивания. В зависимости от качества и глубины библиотеки, данные mRNA-Seq могут быть проанализированы на уровне генных единиц (усреднение чтения насчитывает все экзоны гена), отдельные экзоны или сращивания соединений. данные mRNA-Seq от bru1-IR IFMs по сравнению с диким типом показывают слабые изменения в экспрессии на уровне единицы гена16 (рисунок 5A). На 72 ч APF, уже есть тенденция для саркомере генов, таких как мышцы LIM белка на 60A “Mlp60A”, актин 57B “Act57B”, мышцы конкретных белка 300 kDa »Msp300 », или Stretchin-Mlck “Strn-Mlck”, которые имеют важное значение для правильного развития мышц, которые будут bru1-IR мышцы(Рисунок 5А и дополнительная таблица 1). Тем не менее, мы показали ранее, что на уровне отдельных экзонов, есть гораздо сильнее downregulation конкретных изоформ гена саркомера16, предлагая основной функцией Bruno1 является контроль альтернативных сплайсинга (Дополнительная таблица 1 ). Используя спектрометрию массы цельно-протеома на вскрытии МФМ, мы можем показать аналогичную регулировку на уровне белка(рисунок 5B и Дополнительная таблица 2). Из 1895 обнаруженных пептидных групп 524 (28%) из них неправильно регулируются в Bru1M2 мутант IFM в 1 d взрослых(Дополнительная таблица 2). Снижение как белка Strn-Mlck, так и Mlp60A также наблюдается, сопоставляя наблюдения на уровне стенограммы в наших данных mRNA-Seq. Несмотря на ограниченное количество пептидов базы данных, которые карта конкретных изоформ белка (см. Дополнительные методы для анализа деталей), для саркомера белков Tropomyosin 1 (Tm1), поддержал (вверх /TnT), Mhc, согнуты (bt/projectin) и Paramyosin (Prm) мы наблюдать upregulation пептидов от одного изоформы и downregulation другого(Рисунок 5B), подтверждающие наши предыдущие наблюдения аналогичного регулирования на уровне РНК16. Это свидетельствует о том, что вскрытые ИФМ полезны как для приложений mRNA-Seq, так и для протеомики. В качестве еще один пример того, как омичи данные могут дополнять традиционные подходы для повышения и расширения биологического понимания, мы решили сосредоточиться на сращивания на C-термину mhc. Ранее охарактеризованная линия протеиновых ловушек под названием weeP26 вставляется в окончательный интрон Mhc43,44 (см. Дополнительные методы для точного местоположения). weeP26 содержит сильный сращивания приемителя и включен в предположительно все mhc стенограммы (Рисунок 5C). Тем не менее, GFP помечены белка в IFM включен в две “точки” по обе стороны от M-линии, в то время как в мышцах ног, он включает в себя равномерно через M-линии и слабо через толстые нити (Рисунок 5E). Orfanos и Воробей показал эти “точки” в форме IFM из-за развития Mhc изоформный переключатель: Mhc изоформы выражается до 48 ч APF является GFP помечены как weeP26 экзон вставки в открытой комнате читать, в то время как Mhc изоформа, выраженная после 48 ч APF, не маркирована, так как экзон weeP26 включен ниже по течению стоп-кодона в 3′-UTR44. Наши данные mRNA-Seq позволили нам более детально охарактеризовать изоформное выражение C-терминала Mhc. В то время как два различных mhc прекращения были зарегистрированы43,44, наши данные mRNA-Seq и текущие аннотации Flybase (FB2019-02) предполагают, что Есть на самом деле три возможных альтернативных событий сращивания на Mhc C-термин (Exon 34-35, 34-36, или 34-37)(рисунок 5C),что подтверждается RT-PCR(рисунок 5D). weeP26 GFP вставляется в интрон между Exon 36 и 37; таким образом, поскольку изоформы Exon 34-35 и Exon 34-36 содержат стоп-кодоны, GFP может переводить только в изоформу Exon 34-37 (в результате exon 34-GFP-37). Кроме того, мы могли видеть как временное, так и пространственное регулирование всех изоформ Mhc. В IFM, мы наблюдаем переключатель изоформы Mhc от Exon 34-37 к Exon 34-35 между 30 h APF и 48 h APF(Рисунок 5C,D,F) на 27 C, даже если это пока не видимо иммунофлуоресценцией на 48 h APF(Рисунок 5E). Ноги уже выражают смесь Exon 34-37 и Exon 34-35 на 30 h APF, и на 72 h APF выразить все три изоформы Mhc (Рисунок 5D,F). Взрослый прыжок мышцы (TDT) также выражает все три Mhc изоформы(Рисунок 5F), предполагая, что это, как правило, верно для трубчатых соматических мышц. Таким образом, наши данные mRNA-Seq позволяют расширить предыдущие выводы, сужая временные рамки для изоформного переключателя Mhc в IFM и характеризуя использование изоформы Mhc в трубчатых мышцах. Mhc изоформы регулирования в засолке и bru1 мутант IFM были затем рассмотрены. В обоих случаях мы видели неправильное регулирование weeP26. Salm мутант IFMs не в состоянии завершить развитие переключатель в Mhc изоформы выражения и фенокопии ноги сращивания моделей на более поздних стадиях, в том числе получить Exon 34-36 событие (Рисунок 5F). Это согласуется с предыдущими выводами, что потеря Salm приводит к почти полной судьбе преобразования IFM в трубчатой мышцы16. Bru1-IR и bru1 мутант IFM, похожий на сало-/- IFM, сохраняет Exon 34-37 сращивания событие через взрослых этапов (Рисунок 5E,F), в результате weeP26 GFP маркировки картина, напоминающая мышцы ног, но он не получает Exon 34-36 событие. Это говорит о том, что Bruno1 необходимо в IFM, по крайней мере частично контролировать переключение развития в альтернативном сращивания mhc, но это указывает на то, что дополнительные факторы сращивания также неправильно регулируются в salm-/-контексте. Кроме того, этот пример иллюстрирует, как данные РТ-ПЦР и мРНК-Сек из вскрытых ИФМ могут быть полезны для получения более глубокого понимания механизмов сращивания развития и наблюдаемых морфологических дефектов. Рисунок 1: Разработка IFM и постановка куски. (A) Схема развития IFM на 24 ч APF, 32 ч APF, 48 ч APF, 72 ч APF, и 1 d взрослых показаны уплотнение полет мышц (зеленый) на 32 ч APF и последующего роста волокна для заполнения грудной клетки. Тендоны в темно-сером цвете. (B) Конфокальные изображения фиксированных IfMs из открытых вскрытий книг (24 ч, 32 ч, 48 ч)19 или грудной гемиsections (72 ч, 1 день) окрашенные для актина (родамин фаллоидидин, пурпурный) и GFP (зеленый). (C,D) Изображения флуоресценции GFP в живых куколки иллюстрирующие нетронутыми IFM морфологии вскрытия летать линии в дорсальной (C) или боковой (D) плоскости. Звездочки отмечают местоположение IFM. (E) Чтобы подготовиться к вскрытию, летать запасы должны быть перевернуты или кресты установить 3-4 дней вперед. (F) Prepupae выбраны их белого цвета (желтые наконечники стрел) и изолированы с помощью смачиваемые кисти (F’,F”). (G) Prepupae должны быть секс, чтобы отделить женщин от мужчин на основе присутствия яичек, которые появляются как задние расположены полупрозрачные шары (желтые звездочки). (H) Pupae выдержаны на смачиваемых фильтровальной бумаге в 60 мм посуде. Шкала баров – 100 мкм (B), 1 см (C,D,E,H), 1 мм (F,F’,’G). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2: Рассечение МФМ до 48 ч APF. (A) Добавление буфера 1x PBS к черному рассекая тарелке с пипеткой передачи. (B) Передача постановочных куски с помощью кисти. (C) Под флуоресцентным рассечением микроскопа для визуализации GFP, нежное нажатие куколки на дно рассекающей блюдо с помощью #5 щипц (очерченные серым цветом). “X” в круге обозначает движение в изображении. (D,E) Схватив куколок передним (D), а затем тыкать из куколки сразу за грудной клетки (E). Даш в круге не обозначает движение. (F,G) Тяговая с передней щипцов (стрелка), чтобы удалить pupal случае (F), а затем удаление живота (G). (H) Повторение C-G для нескольких куколки. желтые пунктирные линии пронумероватемы, обозначающие способствующие pupae. (Я, J) Использование щипц (I) для изоляции ИФМ от окружающих тканей (J). Точка в круге обозначает движение из страницы. (K,L) Удаление загрязняющих веществ, включая жировые и прыжки (TDT) мышцы (K) для создания чистой пробы IFM (L). TDT имеет более низкую экспрессию GFP и иную форму, чем волокна IFM(K’). (M,N,O) Использование обрезанного наконечника пипетки (M) для сбора вскрытых МФМ (N) и его переноса в микроцентрифугную трубку (O). Шкала баров 1 см (A,B, M,O), 1 мм (C-G), 500 мкм (H-L,N). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 3: Рассечение МФМ после 48 ч APF. (A) Выравнивание кукота на двойной палкой ленты. (B) Удаление кукота из pupal случае, открыв переднюю (B), резки случае дорсально (B ‘), и снятие куска ( B’). Символы круга представлены так же, как рисунок 2. (C) Перевод куколки в буфер. (D) Удаление живота путем разрезания ножницами (желтые двойные стрелки) и отделение от грудной клетки (D ‘). (E, F) Добавление чистого буфера (E), затем разрезание грудной клетки пополам продольно(F,F’). (G,H) Вскрытие может быть выполнено при белом свете (G) или флуоресценции, чтобы визуализировать GFP (H); резка МФМ с одной стороны (G’), затем с другой стороны (G”); выход из грудной клетки с помощью щипков (очерченных серым цветом) (G”’). (I,J,K) Сбор IFMs в буфере (I) и удаление загрязняющих брюшной нервный шнур (VNC), кишечника и мышцы прыжка (TDT) (J) для создания чистой пробы IFM (K). TDT имеет более низкую экспрессию GFP и иную форму, чем волокна IFM (J’, K’). (L, M) Использование щипц для переноса ИФМ (L) в микроцентрифугную трубку (М). Шкала баров No 1 см (A,E, M), 1 мм (B-D’, F-L). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 4: Сохранение IFM и детали изоляции РНК. (A) IFMs гранулируют центрифугированием в течение 5 мин при 2000 х г. (B) Пряди (стрелка) и гранулы под флуоресценцией (B’). (C) Удаление всего буфера с наконечником пипетки. (D) Для извлечения РНК, повторное приостановление гранул в изоляционном буфере. Этот шаг можно пропустить до сухими заморозками вскрытых МФМ. (E) Замораживание образца в жидком азоте или на сухом льду и хранение при -80 градусах Цельсия. Шкала баров 10 см (A), 1 мм (B,B’), 1 см (C,D,E). (F) Нанограммы (нг) от общего РНК от вскрытого IFM, полученных за муху на 16 ч APF, 24 ч APF, 30 ч APF, 48 ч APF, 72 ч APF, 90 h APF, и 1 d взрослый. Бары ошибок – SD. (G) Всего РНК изолированы от IFM расчлененных из 50 1 d взрослых мух с использованием различных методов извлечения. Бары ошибок – SD. (H) Представитель прослеживает анализ целостности РНК после различных методов извлечения. Рибосомные полосы работают чуть ниже 2000 нуклеотидов (nt) и маркерная полоса на 25 nt. Дополнительные следы доступны в дополнительной рисунок 1. (I) Представитель следы свежеисзоледов RNA образца (вверху), образец замораживания оттаяли 25x на сухом льду (второй участок), образец слева на 4 ч на скамейке (третий участок), и образец, обработанный RNase A (нижний участок). Обратите внимание на полную деградацию РНК при добавлении RNase A. (J) RT-PCR гель из комплектов, помеченных для bru1 и rp49. Относительная интенсивность полосы bru1 нормализуется против rp49, построенная ниже. Бары ошибок – SEM (непарный t-тест, р 0.0119). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 5: Применение вскрытий IFM для исследования функции Bruno1 в альтернативном сращивания. (A)Вулкан участок мРНК-Сек данных (генединица) от IFMs расчленены на 72 ч APF. Гены, которые значительно дифференимационно регулируются между bru1-IR и wildtype IFM (padj slt; 0.05, abs (журнал2FC) Белки саркомера выделены красным цветом, а отдельные гены помечены. (B) Вулкан участок всего протеома масс-спектрометрии результаты от 1 d взрослых IFMs. Белки, значительно отличаемые между брум-мутантами M2и диким типом (FDR ylt; 0.05), показаны синим, незначительными белками в сером цвете. Саркомерики белки выделены красным цветом. Пептиды, соответствующие генам в (A), помечены красным цветом. Наборы пептидов, отображающих различные изоформы одного и того же белка, помечены в одном цвете. (C) Схема C-терминуса Mhc иллюстрируя различные изоформы транскрипта и расположение вставки ловушки гена weeP26 (см. Дополнительные методы для точки вставки). Праймеры RT-PCR обозначаются как черные линии над транскриптами. Чтение на килобазу на миллион баз (RPKM) от mRNA-Seq показано для IFMs расчлененных из дикого типа на 30 ч APF (оранжевый) и 72 ч APF (красный), от bru1-IR (синий) и salm-/- (циан) на 72 h APF и от всей ноги (зеленый) на 72 h APF . (D) RT-PCR с грунтовки против Mhc показаны изоформы переключатель в IFM между 30 ч APF и более поздние временные точки. Exon 34-35 сращивания событие только слабо наблюдается в bruM3мутант IFM или во взрослой ноге. (E) Confocal изображения weeP26 GFP локализации в диких ifM саркомерев на 48 ч APF и 90 ч APF по сравнению с 90 ч мышцы ног APF. Шкала баров No 1 мкм. (F) Сплице перекресток количественной оценки из данных mRNA-Seq для генотипов и таймтов, как помечены. Соединение читает представлены как отношение конкретного события сращивания (Exon 34 до 35 в серый, 34 до 36 в фиолетовом и 34 до 37 в зеленом) к общему числу событий, разделяющих экзон 34 сращивания донора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Дополнительная рисунок 1: (A,B, C) РНК дает из образцов того же генотипа расчлененные тем же исследователем в той же неделе. После того, как все образцы были вскрыты, РНК была изолирована и измерена в тот же день. (A) Нанограммы (нг) общей РНК, полученной от вскрытия IFM на 1 d взрослую муху. Ошибки баров – SEM. (B) Всего РНК, полученных от вскрытых IFM на лету на 30 ч APF, 48 ч APF, 72 ч APF и 1 d взрослых. (C) Общая РНК, изолированная от IFM, расчлененных из 50 1 d взрослых мух, использующих различные методы извлечения. (D) Общая концентрация РНК на лету из расчлененных ног, мышцпрыжся (TDT) и IFM. Больше РНК получено из более крупных МФМ. Бары ошибок – SD. (E) Общие концентрации РНК на лету IFM, расчлененные из элементов управления по сравнению с РНК или образцами мутантов при 30 ч APF, 72 ч APF и 1 d для взрослых. Для мутантов, w1118 был использован в качестве контроля wildtype. Мутантные данные компилируются из bru1-IR, salm-/- и другого РНК-связывающего белка мутанта. Обратите внимание, что для этих манипуляций, РНК дает снижается в 1 d взрослых из-за атрофии мышц и потери, так что больше мух необходимо вскрыть, чтобы получить достаточное количество для омичков подходов. Бары ошибок – SD. (F) Дополнительные следы, показывающие целостность РНК для методов изоляции РНК, показанные на рисунке 4G и на дополнительной рисунке 1C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Дополнительные методы: Подробное описание методов и реагентов, используемых в тексте и, в частности, для генерации данных, показанных на рисунке 1A-D, Рисунок 4F-K, Рисунок 5,Дополнительная таблица 1, и Дополнительная таблица 2. Эти данные мотивируют протокол вскрытия и демонстрируют его полезность для изоляции РНК, мРНК-Сек, РТ-ПЦР и протеомики. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Связанные с рисунком 5 и связанными с ним пунктами в основном тексте Имя вкладки Резюме данных Саркомета Белки Список генов саркомера от Spletter et al. Elife 2018; Здесь мы перечислим текущее FBgn и имя гена. СП генные единицы -DESeq2-72h Используя данные Spletter et al. EMBO Rep 2015, мы специально изучили гены саркомера в данных mRNA-Seq на уровне 72 ч APF. Это из анализа DESeq2 обнаружения дифференциальной экспрессии на уровне единицы гена между контролем (Mef2-Gal4, UAS-GFM-Gma перешли на w1118) и Mef2-Gal4, UAS-GFM-Gma x Bruno1-IR. Строки, выделенные желтым цветом, являются signficantly вверх или вниз регулируемых генов (выше / ниже порога log2FC’abs (1,5)). Эти данные представляют собой накладку красной точки на рисунке 5A. Для каждого гена саркомера мы предоставляем информацию об идентификаторах, log2FC от DESeq2, значение P и скорректированное значение P, а также нормализованные показатели выражения DESeq2. СП Exon-DEXSeq-72h Используя данные Spletter et al. EMBO Rep 2015, мы специально изучили использование гена саркомета в данных mRNA-Seq на уровне 72 ч APF. Это из анализа DEXSeq обнаружения дифференциального использования экзона между контролем (Mef2-Gal4, UAS-GFM-Gma перешли на w1118) и Mef2-Gal4, UAS-GFM-Gma x Bruno1-IR. Строки, выделенные желтым цветом, являются signficantly вверх или вниз регулируемыми экзонами (выше/ниже порога log2FC’abs (1.5)). Мы предоставляем информацию об идентификаторах экзона и генов, log2FC от DEXSeq, значение P и скорректированное значение P, а также список связанных транскриптов. Пожалуйста, обратите внимание, что многие гены показывают регуляцию одного или нескольких экзонов в анализе DEXSeq, часто с высокими значениями log2FC и низким значением P/регулировать значения P, в то время как ограниченный список генов показывает изменения на уровне 72 ч APF. Это поддерживает сильное влияние потери Бруно на регулирование альтернативного сращивания. Дополнительная таблица 1: Таблица 72 ч APF mRNA-Seq данных для саркомеры белков выявления дифференциально выраженных генов (через DESeq2) и экзонов (через DEXSeq) в bru1-IR против. wildtype IFMs. Связанные с рисунком 5B и связанными с ним пунктами в основном тексте Имя вкладки Резюме данных Выход Персея Это таблица обработанных данных, сопомнающая данные масс-спектрометрии, используемые для генерации на рисунке 5B. Образцы IFM взяты из 1 d-контроля для взрослых (w1118) и мух-мутантов (bruno1-M2). Важными столбцовиками являются значения трансформированной интенсивности для каждого из 4 репликантов для каждого образца, статистика и значение T-теста, идентивные идентии пептида и соответствующие имена генов и идентивы Flybase. Signifance был рассчитан с использованием стандартных параметров в Персее (ФДРЗЛ;.05). Обнаружено 1859 белков/пептидов, из которых 524 (28%) значительно отличаются между образцами. Внизрегулируемые Это все 252 белка/ пептиды из продукции Perseus, которые регулируются в bruno1-M2 мутант IFM. Поскольку идентификаторы Flybase и имена генов устарели, мы дополнительно предоставляем текущий идентификатор гена Flybase и имя гена. Upregulated Это все 272 белка/пептиды из продукции Perseus, которые регулируются в bruno1-M2 мутант IFM. Поскольку идентификаторы Flybase и имена генов устарели, мы дополнительно предоставляем текущий идентификатор гена Flybase и имя гена. Обратите внимание, что белки саркомера, выделенные красным цветом на рисунке 5B, присутствуют в приведенных выше списках. Список генов, считающихся частью саркомера, доступен в одной из вкладок в дополнительной таблице 1. Дополнительная таблица 2: Таблица целых данных о масс-спектрометрии протеома от 1 d взрослых, определяющих дифференциально выраженные белки и белковые изоформы в брутальном мутанте M2 против. дикие IFMs.

Discussion

В этом протоколе мы представляем основную методику вскрытия Дрософила IFMs от ранних и поздних стадиях куски для ниже по течению изоляции белка, ДНК, РНК или других макромолекул. Протокол можно легко адаптировать для вскрытия IFM от взрослых мух. Мы демонстрируем полезность нашего протокола вскрытия для приложений mRNA-Seq, протеомики и RT-PCR. С непрерывным совершенствованием омичных технологий, позволяющих анализировать образцы с меньшим исходным материалом и более низкими концентрациями входных данных, эти вскрытия, вероятно, станут ценными для многих дополнительных применений. Как IFMs являются установленной моделью для человеческих миопатий4,24 и мышцного типа конкретного развития9,12, мы представляем, например, IFM-обогащенных метаболомики, исследования хроматина конформации через 3C или 4C, сращивание оценки сети через CLiP взаимодействий или фосфо-протеомики миофибрилломании.

Важно учитывать, что эти вскрытия производят образец, обогащенный для ИФМ, а не чистый образец IFM. Это неизбежно из-за иннервации моторных нейронов, сухожилия вложения и трахеи вторжения мышечных волокон. Анализ биоинформатики может быть использован для выявления обогащенных ифом генов или белков, но необходимы дальнейшие эксперименты, чтобы продемонстрировать, что они на самом деле являются специфическими ДЛЯ IFM. Образец чистоты можно анализировать с помощью опубликованных тканей конкретных маркеров, таких как полоса45 (тендон), Act79B4,44 (трубчатая мышца), Act88F15 (IFM), или сиб46 (нейрональный конкретных). Возможно, можно использовать такие маркеры для нормализации наборов данных в специфическом содержании IFM, однако пользователи предупреждают, что временные изменения в экспрессии генов, используемых для нормализации, например генов, специфичных иФМ, или тубулина, могут привести к смещению такого подхода.

Генетически закодированные ткани конкретных методов маркировки, например, EC-теги47,48 или PABP-маркировки49,50 для изоляции РНК были разработаны в последние годы, которые могут помочь получить действительно ткань-специфический образец РНК. Тем не менее, EC-tagging требует постоянного кормления мух47 и, таким образом, не применяется во время pupal этапов. Чувствительность и полнота транскриптомов с маркировкой PABP может иметь ограничения51. Подходы FACS к изоляции отдельных мышечных волокон осложняются большим и синцитиальным характером ИФМ. INTACT52,53 стиль подходы могут быть применены для изоляции конкретных субклеточных отсеков от IFMs, которые могут оказаться полезными для изоляции чистых популяций ядер IFM или митохондрий. Ручные вскрытия по-прежнему являются текущим стандартом для получения нетронутой ткани IFM для большинства приложений вниз по течению.

Качество образца зависит от нескольких важных шагов в процессе вскрытия. Вскрытия технически требовательны, со скоростью вскрытия и чистотой образца увеличивается с опытом. Вскрытие в течение коротких периодов времени (20-30 мин) в охлажденный буфер без моющего средства и немедленное замораживание помогает сохранить целостность образца, как это наблюдалось ранее для изоляции сухожилий мыши54. IFMs могут быть успешно заморожены после удаления всех буферов из гранул, но специально для изоляции РНК, замораживание образцов в изоляционном буфере, как правило, дают лучшие результаты. IFMs от до 20 отдельных вскрытий объединяются до РНК или белковой изоляции, что позволяет масштабирования и сбора достаточного количества материала, даже с ранних точек времени или мутантов16,32, для анализа вниз по течению.

Для РНК-приложений наиболее важным шагом может быть изоляция самой РНК. Guanidinium thiocyanate-фенол-хлороформ изоляции (метод 1 выше) превосходит большинство коммерческих комплектов испытания и, как отмечалось ранее, значительно дешевле55. Вариабельность наблюдаемых в изоляции РНК дает с коммерческими комплектами в согласии с предыдущими наблюдениями56,57. Мы также добавляем гликоген во время изопропанола осадков, чтобы помочь восстановить все РНК. Помимо выхода РНК, важно проверить целостность РНК, чтобы убедиться, что образец не был фрагментирован или деградирован во время процессов вскрытия и изоляции. Важно также работать Без RNase. Наконец, выбор RT-комплектможет повлиять на чувствительность процесса обратной транскрипции. Хотя все эти моменты не часто обсуждаются подробно, они влияют на качество выборки IFM и данные, полученные из приложений ниже по течению.

Несколько важных изменений отличают протокол от существующих протоколов вскрытия IFM. Хотя подробный протокол вскрытия для иммунофлуоресценции IFM существует19, этот протокол представляет собой другой подход к pupal вскрытий, что позволяет более быструю изоляцию ткани IFM. Это позволяет сбор большого количества ткани IFM (относительно говоря) с ограниченным временем вскрытия, чтобы предотвратить изменения протеома или транскриптома. Другие протоколы описывают вскрытие взрослых IFM для визуализации GFP окрашивания в отдельных миофибрильсов39 или для окрашивания личинок тела стены мышц58, но они не касаются вскрытия на стадии pupal или для изоляции РНК или белка. Этот подход также отличается от существующего протокола для микрорассечения pupal IFMs от криосекций38, которые могут генерировать более чистый образец IFM, но является более трудоемким и производит меньше материала. По сравнению с другими быстрыми взрослыми протоколами вскрытия IFM38,39, IFMs изолированы в буфере PBS без моющего средства, чтобы ограничить индукцию стресса и другие основные изменения выражения.

Ключевым достижением в этом протоколе является включение живого флуоресцентного репортера, позволяющего изоляцию МФМ на ранних стадиях. Мы стандартно используем Mef2-GAL459 за рулем либо UAS-CD8::GFP или UAS-GFP::Gma60. Это позволяет дифференциальной маркировки IFM (полет мышцы более сильно помечены и по-разному формы, чем другие мышцы pupal), а также выполнение GAL4-UAS основе манипуляций, например, спасательные или РНК экспериментов. Также можно комбинировать Mef2-GAL4 с ванной-GAL80ts, чтобы избежать РАНК-связанных ранней летальности или с UAS-Dcr2 для повышения эффективности РНК40.

Есть дополнительные драйверы GAL4 или GFP-линии доступны, которые различаются по специфике мышечного типа, височное выражение шаблона, и сила водителя19,61, которые могут быть использованы вместо Mef2-GAL4. Например, Act88F-GAL4 сначала выражается около 24 ч APF, поэтому он не может быть использован для более ранних временных точек; однако, он сильно маркирует IFM и может быть полезн для того чтобы во избежание RNAi-связанные ранняя летальность. Он-GFP или Act88F-GFP этикетке IFM, опять же с временными ограничениями, но они избегают GAL4 зависимость маркера выражения и может быть полезным в сочетании с мутантным фоном интереса. Списки других возможных линий маркера доступны19. Следует также отметить, что использование трансгенов и системы GAL4/UAS может вызвать артефакты экспрессии генов, поэтому важно использовать соответствующие элементы управления, например, линию водителя, пересекаемую с фоновым штаммом дикого типа, так что такие артефакты предположительно же во всех образцах.

С сопроводительным видео, этот подробный протокол направлен на то, чтобы сделать pupal IFM вскрытие более доступным и содействовать использованию омиков подходы для изучения развития мышц. Соединение силы генетики дрозофилы и клеточной биологии с биохимией и омиками, доступными через расчлененные ИФМ, имеет потенциал для продвижения механистического понимания миогенеза и мышечной функции. Будущие исследования, связывающие системные наблюдения транскриптома и регуляции протеома с метаболическими и функциональными выходами, обеспечат более глубокое понимание специфического развития мышечного типа и патогенеза мышечных расстройств.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарны Андреасу Ладурнеру и Франку Шноррере за щедрую поддержку. Мы благодарим Сандра Эссер за отличную техническую помощь и Akanksha Roy для генерации данных масс-спектрометрии. Мы признаем Блумингтон и Венский фондовые центры для обеспечения мух. Мы благодарим Bioimaging Core Facility за помощь в конфокальной визуализации и Зантраллабор фюрер Протеинаналитик для анализа образцов масс-спектрометрии, как в Биомедицинском Центре ЛМУ (Martinsried, DE). Наша работа была поддержана Deutsche Forschungs Gemeinschaft (MLS, SP 1662/3-1), Центром интегрированных белковых наук Мюнхена (CIPSM) в Людвиг-Максимилианс-Университет Мюнхен (MLS), Фредерик-Бауэр Stiftung (MLS), и Международный Макс Научно-исследовательская школа Планка (EN).

Materials

5x High Fidelity (HF) buffer Thermo Fisher F518L
60 mm culture dishes Sigma-Aldrich Z643084-600EA Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented
black dissecting dish (glass) Augusta Laborbedarf 42021010 Lymphbecken, black glass, 4×4 cm
black silicon dissecting dishes: activated charcoal powder Sigma-Aldrich C9157 Also available from most pharmacies
black silicon dissecting dishes: Sylgard 184 Sigma-Aldrich 761036 Dishes are made by mixing the Sylgard (~50g) with activated charcoal powder (200 mg) and curing it in Petri dishes (~4 60 mm dishes).
blue pestle Sigma-Aldrich Z359947-100EA Any pellet pestle that can sterilized, also can be used with a motor-driven grinder
cell phone camera, Samsung Galaxy S9 Samsung SM-G960F/DS used for photos not taken under a microscope
chloroform PanReac AppliChem A3691,0500
confocal microscope, Leica SP8X upright confocal Leica www.leica-microsystems.com
confocal microscope, Zeiss LSM 780 inverted confocal Zeiss www.zeiss.com
double stick tape Scotch/3M 3M ID 70005108587 Double-sided tape, available at most office supply handlers
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 x 0.02 mm tip
EtOH (100%, RNase free) Sigma-Aldrich 32205-M
fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera Leica www.leica-microsystems.com
fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0 Leica www.leica-microsystems.com
fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC Leica www.leica-microsystems.com
Fly: Bru1[M2] Fly stock; This paper
Fly: Bru1[M3] Fly stock; This paper
Fly: Mef2-GAL4 Bloomington Stock Center BDSC:27390 Fly stock
Fly: salm[1] Bloomington Stock Center 3274 Fly stock
Fly: salm[FRT] Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018
Fly: UAS-Bru1IR Vienna Drosophila Research Center GD41568 Fly stock, RNAi hairpin
Fly: UAS-GFP::Gma Bloomington Stock Center BDSC:31776 Fly stock
Fly: UAS-mCD8a::GFP Bloomington Stock Center BDSC:5130 Fly stock
Fly: w[1118] Bloomington Stock Center 3605 Fly stock
Fly: weeP26 Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003
GFP detection reagent, GFP-Booster ChromoTek gba488-100
glycogen Invitrogen 10814-010
image processing software, Photoshop CS6 Adobe www.adobe.com
isopropanol Sigma-Aldrich I9516-25ML 2-propanol
Method 1 (RNA isolation): TRIzol Life Technologies 15596018 Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution
Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit Invitrogen AM1907 TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA
Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit Zymo Research R2070S RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer.
Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134 We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues.
Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System Promega Z6110 We applied the protocol for ‘Purification of RNA from Fibrous Tissues’.
Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit New England Biolabs T2010G We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 μL of RNA Protection Reagent.
Microcentrifuge tubes Thermo Fisher AM12400 RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL
Microscope slides Thermo Fisher 12342108 Standard slides, uncharged, 1 mm
microtome blades PFM Medical 207500003 C35 feather 80mm
Monarch DNase I New England Biolabs T2004-21
Monarch DNase I Reaction Buffer New England Biolabs T2005-21
normal goat serum Thermo Fisher 16210072
OneTaq Polymerase New England Biolabs M0480X
Paintbrush Marabu 1910000000 Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
PBS buffer (1x) Sigma-Aldrich P4417 Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4
PFA PureTip Pipette Tips Elemental Scientific ES-7000-0101 Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice
Phusion High Fidelity Polymerase Thermo Fisher F-530XL
Pipette tips Sigma-Aldrich P5161 Universal 200 mL pipette tips
Preomics iST 8x Kit Preomics P.O.00001 peptide preparation kit for mass spectrometry
Q Exactive mass spectrometer Thermo Fisher 725500 mass spectrometry was performed at the Protein Analysis Unit of the LMU Biomedical Center
Qubit RNA Assay Kit Life Technologies Q32855
rhodamine-phalloidin Invitrogen, Molecular Probes 10063052
RNA concentration Approach 1 & RNA integrity traces, Bioanalyzer Agilent Technologies G2939BA
RNA concentration Approach 2, Nanodrop Thermo Fisher ND-2000
RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer Invitrogen Q33238
RNA Pico Chips Agilent Technologies 5067-1513
RNase A Promega A7937
RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich D5758 DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase.
RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit Invitrogen 18080-044 reverse transcription kit
RT Kit #2: LunaScript New England Biolabs E3010S reverse transcription kit
RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit Qiagen 205410 reverse transcription kit
slide mounting buffer, Vectashield Vector Laboratories H-1200 containing DAPI
statistical software: GraphPad Prism GraphPad Prism www.graphpad.com
statistical software: Microscoft Excel Microsoft Purchased as part of the bundle: Office Home & Student 2019
Table-top centrifuge Eppendorf 5405000760 Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent
tissue/ Kimwipes Sigma-Aldrich Z188956 Standard tissue wipes
Transfer pipette Sigma-Aldrich Z350796 Plastic pipette
Triton-X100 Sigma-Aldrich T9284-500ML
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-00 3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm
Whatman paper Sigma-Aldrich 1004-070 Filter paper circles, Grade 4, 70 mm
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rexiati, M., Sun, M., Guo, W. Muscle-Specific Mis-Splicing and Heart Disease Exemplified by RBM20. Genes. 9 (1), 18 (2018).
  2. Guo, W., et al. RBM20, a gene for hereditary cardiomyopathy, regulates titin splicing. Nature Medicine. 18 (5), 766-773 (2012).
  3. Guo, W., et al. Splicing Factor RBM20 Regulates Transcriptional Network of Titin Associated and Calcium Handling Genes in The Heart. International Journal of Biological Sciences. 14 (4), 369-380 (2018).
  4. Nikonova, E., Kao, S. -. Y., Ravichandran, K., Wittner, A., Spletter, M. L. Conserved functions of RNA-binding proteins in muscle. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 110, 29-49 (2019).
  5. Wang, E. T., et al. Dysregulation of mRNA Localization and Translation in Genetic Disease. The Journal of Neuroscience. 36 (45), 11418-11426 (2016).
  6. Wang, E. T., et al. Antagonistic regulation of mRNA expression and splicing by CELF and MBNL proteins. Genome Research. 25 (6), 858-871 (2015).
  7. Kalsotra, A., et al. A postnatal switch of CELF and MBNL proteins reprograms alternative splicing in the developing heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20333-20338 (2008).
  8. Ho, T. H., et al. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. The EMBO Journal. 23 (15), 3103-3112 (2004).
  9. Lemke, S. B., Schnorrer, F. Mechanical forces during muscle development. Mechanisms of Development. 144, 92-101 (2017).
  10. Iwamoto, H. Structure, function and evolution of insect flight muscle. Biophysics. 7, 21-28 (2011).
  11. Schnorrer, F., Dickson, B. J. Muscle building; mechanisms of myotube guidance and attachment site selection. Developmental Cell. 7 (1), 9-20 (2004).
  12. Spletter, M. L., Schnorrer, F. Transcriptional regulation and alternative splicing cooperate in muscle fiber-type specification in flies and mammals. Experimental Cell Research. 321 (1), 90-98 (2014).
  13. Benoist, P., Mas, J. A., Marco, R., Cervera, M. Differential muscle-type expression of the Drosophila troponin T gene. A 3-base pair microexon is involved in visceral and adult hypodermic muscle specification. Journal of Biological Chemistry. 273 (13), 7538-7546 (1998).
  14. Schönbauer, C., et al. Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects. Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).
  15. Bryantsev, A. L., et al. Extradenticle and Homothorax Control Adult Muscle Fiber Identity in Drosophila. Developmental Cell. 23 (3), 664-673 (2012).
  16. Spletter, M. L., et al. The RNA-binding protein Arrest (Bruno) regulates alternative splicing to enable myofibril maturation in Drosophila flight muscle. EMBO Reports. 16 (2), 178-191 (2015).
  17. Oas, S. T., Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. Arrest is a regulator of fiber-specific alternative splicing in the indirect flight muscles of Drosophila. The Journal of Cell Biology. 206 (7), 895-908 (2014).
  18. Kim, J. H., Jin, P., Duan, R., Chen, E. H. ScienceDirect Mechanisms of myoblast fusion during muscle development. Current Opinion in Genetics & Development. 32, 162-170 (2015).
  19. Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
  20. Rai, M., Nongthomba, U., Grounds, M. D. Skeletal Muscle Degeneration and Regeneration in Mice and Flies. Mechanisms of Regeneration. 108, 247-281 (2014).
  21. Swank, D. M., Wells, L., Kronert, W. A., Morrill, G. E., Bernstein, S. I. Determining structure/function relationships for sarcomeric myosin heavy chain by genetic and transgenic manipulation of Drosophila. Microscopy Research and Technique. 50 (6), 430-442 (2000).
  22. de Joussineau, C., Bataillé, L., Jagla, T., Jagla, K. Diversification of muscle types in Drosophila: upstream and downstream of identity genes. Current Topics in Developmental Biology. 98, 277-301 (2012).
  23. Maqbool, T., Jagla, K. Genetic control of muscle development: learning from Drosophila. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 28 (7-8), 397-407 (2008).
  24. Jagla, K., Kalman, B., Boudou, T., Hénon, S., Batonnet-Pichon, S. Beyond mice: Emerging and transdisciplinary models for the study of early-onset myopathies. Seminars in Cell & Developmental Biology. 64, 171-180 (2017).
  25. Haigh, S. E., et al. Drosophila indirect flight muscle specific Act88F actin mutants as a model system for studying congenital myopathies of the human ACTA1 skeletal muscle actin gene. Neuromuscular Disorders. 20 (6), 363-374 (2010).
  26. Batonnet-Pichon, S., et al. Myofibrillar Myopathies: New Perspectives from Animal Models to Potential Therapeutic Approaches. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (1), 1-15 (2017).
  27. Kreipke, R. E., Kwon, Y. V., Shcherbata, H. R., Ruohola-Baker, H. Drosophila melanogaster as a Model of Muscle Degeneration Disorders. Current Topics in Developmental Biology. 121, 83-109 (2017).
  28. Souidi, A., Zmojdzian, M., Jagla, K. Dissecting Pathogenetic Mechanisms and Therapeutic Strategies in Drosophila Models of Myotonic Dystrophy Type 1. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 4104 (2018).
  29. Sparrow, J., Hughes, S. M., Segalat, L. Other Model Organisms for Sarcomeric Muscle Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 642, 192-206 (2008).
  30. Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 1184, 1-20 (2010).
  31. Swank, D. M. Mechanical analysis of Drosophila indirect flight and jump muscles. Methods. 56 (1), 69-77 (2012).
  32. Spletter, M. L., et al. A transcriptomics resource reveals a transcriptional transition during ordered sarcomere morphogenesis in flight muscle. eLife. 7, 1361 (2018).
  33. Weitkunat, M., Kaya-Çopur, A., Grill, S. W., Schnorrer, F. Tension and force-resistant attachment are essential for myofibrillogenesis in Drosophila flight muscle. Current Biology. 24 (7), 705-716 (2014).
  34. Gunage, R. D., Dhanyasi, N., Reichert, H., VijayRaghavan, K. Drosophila adult muscle development and regeneration. Seminars in Cell & Developmental Biology. 72, 56-66 (2017).
  35. Weitkunat, M., Brasse, M., Bausch, A. R., Schnorrer, F. Mechanical tension and spontaneous muscle twitching precede the formation of cross-striated muscle in vivo. Development. 144 (7), 1261-1272 (2017).
  36. Zappia, M. P., Rogers, A., Islam, A. B. M. M. K., Frolov, M. V. Rbf Activates the Myogenic Transcriptional Program to Promote Skeletal Muscle Differentiation. Cell Reports. 26 (3), 702-719 (2019).
  37. Zappia, M. P., Frolov, M. V. E2F function in muscle growth is necessary and sufficient for viability in Drosophila. Nature Communications. 7 (1), 10509 (2016).
  38. Bryantsev, A. L., et al. Myogenesis in Drosophila melanogaster: Dissection of Distinct Muscle Types for Molecular Analysis. Methods in Molecular Biology. 1889 (5), 267-281 (2019).
  39. Xiao, Y. S., Schöck, F., González-Morales, N. Rapid IFM Dissection for Visualizing Fluorescently Tagged Sarcomeric Proteins. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
  40. Kaya-Çopur, A., Schnorrer, F. RNA Interference Screening for Genes Regulating Drosophila Muscle Morphogenesis. Myogenesis. 1889, 331-348 (2019).
  41. Chechenova, M. B., et al. Functional redundancy and non-redundancy between two Troponin C isoforms in Drosophila adult muscles. Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 760-770 (2017).
  42. Alberts, B. . Molecular Biology of the Cell. , (2017).
  43. Clyne, P. J., Brotman, J. S., Sweeney, S. T., Davis, G. Green fluorescent protein tagging Drosophila proteins at their native genomic loci with small P elements. Genetics. 165 (3), 1433-1441 (2003).
  44. Orfanos, Z., Sparrow, J. C. Myosin isoform switching during assembly of the Drosophila flight muscle thick filament lattice. Journal of Cell Science. 126 (1), 139-148 (2013).
  45. Volohonsky, G., Edenfeld, G., Klambt, C., Volk, T. Muscle-dependent maturation of tendon cells is induced by post-transcriptional regulation of stripeA. Development. 134 (2), 347-356 (2007).
  46. Estes, P. S., Ho, G. L., Narayanan, R., Ramaswami, M. Synaptic localization and restricted diffusion of a Drosophila neuronal synaptobrevin–green fluorescent protein chimera in vivo. Journal of Neurogenetics. 13 (4), 233-255 (2000).
  47. Hida, N., et al. EC-tagging allows cell type-specific RNA analysis. Nucleic Acids Research. 45 (15), 138 (2017).
  48. Thomas, A., et al. A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila. PLoS ONE. 7 (7), 40276 (2012).
  49. Yang, Z. Isolation of mRNA from specific tissues of Drosophila by mRNA tagging. Nucleic Acids Research. 33 (17), 148 (2005).
  50. Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 14110-14115 (2007).
  51. Blazie, S. M., et al. Comparative RNA-Seq analysis reveals pervasive tissue-specific alternative polyadenylation in Caenorhabditis elegans intestine and muscles. BMC Biology. 13 (1), 1775-1821 (2015).
  52. Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. Cell type-specific genomics of Drosophila neurons. Nucleic Acids Research. 40 (19), 9691-9704 (2012).
  53. Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nature Protocols. 6 (1), 56-68 (2011).
  54. Grinstein, M., Dingwall, H. L., Shah, R. R., Capellini, T. D., Galloway, J. L. A robust method for RNA extraction and purification from a single adult mouse tendon. PeerJ. 6 (8), 4664 (2018).
  55. Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning. , (2012).
  56. Brown, R. A. M., et al. Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal. BMC Biotechnology. 18 (1), 16 (2018).
  57. Ford, K. L., et al. Optimisation of laboratory methods for whole transcriptomic RNA analyses in human left ventricular biopsies and blood samples of clinical relevance. PLoS ONE. 14 (3), 02136855 (2019).
  58. Ramachandran, P., Budnik, V. Dissection of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harbor Protocols. (8), 5469 (2010).
  59. Ranganayakulu, G., Schulz, R. A., Olson, E. N. Wingless signaling induces nautilus expression in the ventral mesoderm of the Drosophila embryo. Developmental Biology. 176 (1), 143-148 (1996).
  60. Dutta, D., Bloor, J. W., Ruiz-Gómez, M., VijayRaghavan, K., Kiehart, D. P. Real-time imaging of morphogenetic movements in Drosophila using Gal4-UAS-driven expression of GFP fused to the actin-binding domain of moesin. Genesis. 34 (1-2), 146-151 (2002).
  61. Lemke, S. B., Schnorrer, F. In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae. Journal of Visualized Experiments. (132), e57312 (2018).

Tags

Drosophila MelanogasterFlight MusclesDissectionOmics ApproachesGFP-labeledIndirect Flight MusclePupae DevelopmentGene ExpressionProtein ExpressionRT-PCRWestern BlotStagingSexingFluorescent MicroscopyForcepsPBS

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kao, S., Nikonova, E., Ravichandran, K., Spletter, M. L. Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches. J. Vis. Exp. (152), e60309, doi:10.3791/60309 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image