JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

Dissectie van vlucht spieren van Drosophila melanogaster voor omics-benaderingen

Published: October 17, 2019
doi:
10.3791/60309
, , ,
1Biomedical Center, Department of Physiological Chemistry,Ludwig-Maximilians-University Munich, 2Center for Integrated Protein Science Munich (CIPSM), Department of Chemistry,Ludwig-Maximilians-University Munich

Summary

Drosophila Flight Muscle is een krachtig model om transcriptionele regulering, alternatieve splicing, metabolisme en mechanobiologie te bestuderen. We presenteren een protocol voor dissectie van TL-gelabelde Flight muscle van Live poppen voor het genereren van zeer verrijkte monsters ideaal voor proteomica en Deep-sequencing. Deze monsters kunnen belangrijke mechanistische inzichten bieden in diverse aspecten van spierontwikkeling.

Abstract

Drosophila Flight Muscle is een krachtig model om diverse processen te bestuderen, zoals transcriptionele regulering, alternatieve splicing, metabolisme en mechanobiologie, die allemaal van invloed zijn op de spierontwikkeling en myofibrillogenese. Omics-gegevens, zoals die worden gegenereerd door massaspectrometrie of diepe sequentiëring, kunnen belangrijke mechanistische inzichten in deze biologische processen bieden. Voor dergelijke benaderingen is het nuttig om weefsel-specifieke monsters te analyseren om zowel de selectiviteit als de specificiteit van de omics-vingerafdrukken te verhogen. Hier presenteren we een protocol voor dissectie van TL-gelabelde Flight muscle van Live poppen om sterk verrijkte spier monsters te genereren voor omics-toepassingen. We beschrijven eerst hoe vlieg spieren te ontleden in vroege exuviae stadia ( 48 h APF) of volwassenen, wanneer spieren te onderscheiden zijn onder een ontleed Microscoop. Het begeleidende video protocol zal deze technisch veeleisende dissecties breder toegankelijk maken voor de spier-en Drosophila onderzoeksgemeenschappen. Voor RNA-toepassingen, testen we de hoeveelheid en de kwaliteit van RNA die kunnen worden geïsoleerd op verschillende tijdstippen en met verschillende benaderingen. Verder tonen we aan dat Bruno1 (Bru1) noodzakelijk is voor een tijdelijke verschuiving in myosin zware keten (MHC) splicing, demonstreren dat ontleed spieren kunnen worden gebruikt voor mRNA-seq, massaspectrometrie, en omgekeerde transcriptie polymerase kettingreactie (RT-PCR) Toepassingen. Dit dissectie protocol zal helpen bij het bevorderen van Weefselspecifieke omics-analyses en kan over het algemeen worden toegepast om meerdere biologische aspecten van myogenese te bestuderen.

Introduction

Moderne Omics-technologieën bieden belangrijke inzichten in de spierontwikkeling en de onderliggende mechanismen van menselijke spieraandoeningen. Bijvoorbeeld, analyse van transcriptomics gegevens in combinatie met genetische en biochemische controle in diermodellen is gebleken dat verlies van de splicing factor RBM20 veroorzaakt verwijde cardiomyopathie als gevolg van de regulering van een doelnetwerk van meer dan 30 sarcomere genen die eerder geassocieerd werden met hart-en vaatziekten, waaronder titin1,2,3.

In een tweede voorbeeld hebben studies van celkweek, diermodellen en humane patiënten aangetoond dat myotonische dystrofie wordt veroorzaakt door een verstoring van de RNA-regulatie als gevolg van de sekwestratie van muscleblind (mbnl) en opregulatie van CELF14,5. De cross-regelgevende en temporele dynamiek tussen MBNL en CELF1 (ook wel CUGBP1 of Bruno-like 2 genoemd) helpen om de aanhoudende embryonale splicing patronen uit te leggen bij patiënten met myotonische dystrofie. Bovendien helpt het grote netwerk van niet-gereguleerde doelen om de complexe aard van de ziekte4,6,7,8uit te leggen. Een meerderheid van dergelijke studies gebruiken omics benaderingen in genetische model organismen om te begrijpen van de mechanismen die onderliggende menselijke spierziekte. Bovendien benadrukken ze het belang van het eerste begrip van temporele en weefsel-type specifieke genexpressie, eiwit modificatie, en metabole patronen in gezonde spieren om veranderingen in zieke of verouderende spieren te begrijpen.

Drosophila melanogaster is een ander, goed opgezet genetisch modelorganisme. De structuur van de sarcomere en individuele sarcomere componenten worden sterk bewaard van vliegen naar gewervelde dieren4,9,10, en de indirecte vlucht spieren (IFMS) zijn uitgegroeid tot een krachtig model om te studeren meerdere aspecten van de spierontwikkeling11,12. Eerste, de fibrillar vlucht spieren zijn functioneel en morfologisch onderscheiden van buisvormige lichaamsspieren11,13, waardoor onderzoek van spier-type specifieke ontwikkelingsmechanismen. Transcriptiefactoren, waaronder Spalt Major (Salm)14, extradenticle (Exd), en Homothorax (HTH)15 zijn geïdentificeerd als fibrillar Fate regulators. Bovendien stuurt de CELF1 homo Bruno1 (Bru1, Aret), stroomafwaarts van Salm, een fibrillar-specifiek splicing programma16,17.

Ten tweede zijn IFMS een belangrijk model voor het begrijpen van het proces van myogenese zelf, van Myoblast fusie en myotube gehechtheid aan myofibrillogenese en sarcomere rijping9,18,19. Ten derde, Drosophila genetica maakt onderzoek van bijdragen door individuele eiwitten, eiwit domeinen, en eiwit isovormen aan sarcomere vorming, functie, en biofysische eigenschappen20,21,22 ,23. Ten slotte zijn IFM-modellen ontwikkeld voor de studie van meerdere menselijke spieraandoeningen, zoals myotonische dystrofie, myofibrillaire myopathieën, spier degeneratieve aandoeningen, actinopathieën, enz.24,25,26 ,27, en hebben belangrijke inzichten gegeven in ziekte mechanismen en mogelijke therapieën28,29,30. Dus, Drosophila is een nuttig model om veel open vragen in de myogenese veld, met inbegrip van mechanismen van spier-type specifieke transcriptie, splicing, en chromatine regulering, evenals de rol van metabolisme in spierontwikkeling. De toepassing van moderne Omics-technologieën, in het bijzonder in combinatie met de grote verscheidenheid aan genetische, biochemische en celbiologische assays die beschikbaar zijn in Drosophila, heeft het potentieel om het begrip van spier massa drastisch te ontwikkeling, veroudering en ziekte.

IFMS zijn de grootste spieren in de vlieg, die bijna 1 mm over de gehele lengte van de thorax beslaan bij volwassenen31,32. Dit kleine formaat genereert echter de uitdaging om voldoende monster te verkrijgen om Omics-technologieën in Drosophila op een specifieke manier van het type weefsel toe te passen. Bovendien zijn ifm’s onderdeel van de volwassen spier massa die tijdens de exuviae-stadia wordt gevormd. Myoblasten zekering te vormen myotubes, die hechten aan pezen rond 24 h na Puparium vorming (APF) en ondergaan een verdichtings stap nodig om te initiëren myofibrillogenese rond 30 h APF (Figuur 1a-D)18,33, 34.

De myofibers groeien dan tot de gehele lengte van de thorax, met myofibrillen ondergaat een initiële groeifase gericht op sarcomere optellen tot ongeveer 48 h APF, en vervolgens overstappen naar een rijpingsfase, waarin sarcomeres groeien in lengte en breedte en zijn gerenoveerd om stretch-activatie door 72 h APF vast te stellen (afbeelding 1A-D)32,35. Het begin van de rijping van vezels wordt op zijn minst gedeeltelijk beheerst door Salm en E2F32,36,37, en meerdere IFM-specifieke sarcomere eiwit isovormen waarvan de splicing wordt gecontroleerd door Bru1 zijn opgenomen tijdens deze fase16,17. Volwassen vliegen Eclose van 90 – 100 h APF. Dit betekent dat om spierontwikkeling te bestuderen, IFM moet worden geïsoleerd met voldoende hoeveelheid, kwaliteit en zuiverheid van meerdere exuviae-tijdpunten om de analyse met omics-benaderingen te vergemakkelijken.

Er zijn verschillende protocollen voor IFM-dissectie gepubliceerd. Hoewel deze protocollen goed werken voor de beoogde toepassingen, zijn geen van beide ideaal voor omics-benaderingen. Protocollen die de morfologie van IFM behouden voor immunofluorescentie van exuviae en volwassen IFMS19, isoleren van IFM-vezels voor mechanische evaluatie31, of gebruik maken van micro dissectie van exuviae IFM van cryosecties38 zijn te gespecialiseerd en tijd en arbeidsintensief voor het redelijkerwijs verkrijgen van voldoende hoeveelheden IFM-weefsel voor omics-toepassingen. Andere protocollen zijn ontwikkeld voor een snelle dissectie van specifiek volwassen IFM38,39, zijn dus niet van toepassing op exuviae stadia, en gebruiken buffers die niet ideaal zijn of onverenigbaar kunnen zijn met bijvoorbeeld RNA-isolatie. Er is dus behoefte aan het ontwikkelen van nieuwe benaderingen om exuviae IFM te isoleren voor Biochemie of omics-toepassingen.

Hier presenteren we een protocol voor de dissectie van IFM tijdens exuviae stadia die met succes is gebruikt voor mRNA-SEQ analyse van 16 h APF door volwassen stadia16,32. Het protocol maakt gebruik van een groen fluorescerende proteïne (GFP) label om te identificeren IFMS in alle stadia van exuviae en volwassen ontwikkeling, waardoor Live dissectie onder een fluorescerende ontleed Microscoop. De aanpak is minder arbeidsintensieve, met een hogere doorvoer dan bestaande IFM dissectie-protocollen. Dit maakt een snelle isolatie en cryopreservering van monsters mogelijk, waardoor genoeg materiaal wordt gegenereerd na verschillende rondes van dissectie voor omics-benaderingen, evenals voor standaard reverse transcriptie-polymerase kettingreactie (RT-PCR) of Western-blotting.

We presenteren het protocol in twee delen, demonstreren hoe snel te ontleden IFMS zowel vóór 48 h APF (tijdens vroege metamorfose, wanneer IFM-bijlagen zijn meer zwak) en na 48 h APF (wanneer de exuviae lichaam plan en IFM-bijlagen zijn goed gedefinieerd). We laten zien dat we RNA van hoge kwaliteit kunnen isoleren van ontleed IFMs op alle tijdspunten en gegevens presenteren over verschillende benaderingen van RNA-isolatie en omgekeerde transcriptie. Tot slot tonen we de toepassing van het dissectie protocol op mRNA-seq, Mass spectrometrie en RT-PCR met behulp van de CELF1 homo Bruno1 als voorbeeld. We tonen misexpression van sarcomere eiwit isovormen in proteomica data van Bruno1 Mutant IFM en onderzoeken Bruno1 regulatie van de C-Terminal Splice Event van myosin Heavy Chain (MHC). Deze resultaten illustreren hoe omics-gegevens een dieper begrip van biologische fenomenen kunnen opleveren, waarbij genetische en biochemische experimenten worden aangevuld.

Protocol

1. het faseren van de Pupae Til de vliegen van het gewenste genotype op in flessen (Figuur 1E). Ofwel Maak een frisse Flip van de dissectie voorraad of stel een kruis met ten minste 20 vrouwelijke Maagd vliegen. Handhaaf flessen totdat de vliegen beginnen te puperen. Verzamel pre-pupae met een bevoafd penseel en breng het over naar bevoafd filtreerpapier in een 60 mm Petri schaaltje (Figuur 1F). Geslacht de pupae, het verzamelen van het juiste geslacht voor het experiment (Figuur 1G). Mannetjes worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van teelballen, die verschijnen als doorschijnende ballen in de verder ondoorzichtige PUPA. Label de Petri schaal met de tijd, datum en genotype, en vervolgens de poppen naar de gewenste fase (Figuur 1H).Opmerking: Houd de kruisingen/voorraden en de leeftijd van de poppen in een met temperatuur gecontroleerde incubator (d.w.z. 25 °c of 27 °c voor RNAi-kruisen, aangezien verhoogde Gal4-activiteit bij hogere temperaturen de terugslag-efficiëntie verhoogt40). Zorg ervoor dat de luchtvochtigheid voldoende hoog is, zodat de poppen niet uitdrogen bij het ouder worden van meerdere dagen. 2. IFM dissectie vóór 48 h APF Monteer de benodigde apparatuur, waaronder twee #5 biologie grade Tang, een pipet, pipetpunten, droogijs, en (voor RNA-monsters) isolatie reagens (Zie tabel met materialen). Bovendien chill-out zwarte ontleed gerechten (Zie tabel van de materialen), 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) buffer, en 1,5 ml micro centrifugebuizen op ijs. Met behulp van een bevoafd penseel, overdracht geënsceneerde poppen naar een zwarte ontleden gerecht gevuld ongeveer tweederde met koud 1x PBS (Figuur 2a, B). Ga naar een fluorescerende ontsnij Microscoop.Opmerking: Gebruik zo veel poppen als kan worden ontleed binnen een 30 min tijdvenster. Afhankelijk van de ervaring varieert dit van 3 tot 15 pupae. Zie aanvullende methoden voor de bespreking van alternatieven voor zwarte ontleden gerechten. Gebruik #5 Tang, duw een van de poppen naar de onderkant van een zwarte ontleden Dish en stel de zoom van de Microscoop in en focus om de PUPA duidelijk te zien (Figuur 2C). Pak de voorste van de PUPA met een tang (Figuur 2D), en POKE de poppen met een enkele punt van de andere Tang iets buiten het midden in de buik, net achter de thorax. Dit houdt de PUPA op zijn plaats en voorkomt dat de IFMs in de buik bewegen (Figuur 2E).Opmerking: Begin de timing van de lengte van dissectie vanaf dit punt, zodra de exuviae-integriteit wordt verstoord. Gebruik een gedefinieerde lengte van dissectie (bijvoorbeeld 20 – 30 min) om de spier dood te minimaliseren en bijbehorende transcriptomische en proteomische veranderingen. Ontleden zo veel mogelijk vliegen in deze periode. Verwijder met behulp van de eerste Tang de voorste helft van de exuviae-kast (Figuur 2F). Gebruik dezelfde pincet om de blootgestelde poppen vlak achter de thorax te knijpen en scheid de buik van de thorax (Figuur 2G). Gebruik de Tang en Knijp zachtjes in het voorste deel van de thorax (voor < 35 h APF) of open de thorax om de fluorescently gelabelde IFMs bloot te leggen (Figuur 2h). IFMs zal gemakkelijk loskoppelen van de epidermis, als pees bijlagen op vroege tijdpunten zijn kwetsbaar. Gooi het overgebleven karkas weg met de tang om het naar de andere kant van de schaal te duwen. Herhaal stappen 2.3 – 2.7, ontleden extra pupae. Verzamel de IFM-vezels met een tang en organiseer ze in een stapel aan de onderkant van de zwarte ontleden Dish (Figuur 2I, J). Verwijder het vuil door het uit het gezichtsveld te duwen met behulp van een tang.Opmerking: Met de praktijk kunnen de Tang tips in de buurt worden gebracht zonder elkaar aan te raken. Deze techniek kan worden gebruikt om losjes te grijpen IFMs zonder ze te vernietigen. Alternatieve methoden omvatten het zachtjes duwen of tillen van de IFMs met een enkele tip of volledig gesloten tang, of het nemen van sommige vet of ander weefsel met de IFM en het verwijderen van het vet zoals beschreven in stap 2,10. Kwaliteitscontrole van het IFM-spier monster, met behulp van de tang om niet-IFM-spieren, vet, cuticula, etc. uit het monster te verwijderen (Figuur 2K, L).Opmerking: Met Mef2-Gal4, IFM is gelabeld krachtiger dan andere spier typen op vroege tijdpunten (Figuur 2k, k ‘), waardoor verwijdering van sprong spier en larvale spieren op basis van fluorescentie intensiteit en spier vorm. Vet en cuticula weefsel zien er anders uit en worden niet aangeduid met een spierspecifiek fluorescentie label (Figuur 2k, k ‘). Zie de sectie discussie voor andere Gal4 regels die het label IFM. Breng met een geknipte pipetpunt de stapel IFMs over in een micro centrifugebuis van 1,5 mL gevuld met 250 μL gekoeld 1x PBS (Figuur 2M-O). Ga onmiddellijk naar rubriek 4.Opmerking: IFM-samples kunnen verloren gaan door simpelweg aan de zijkant van de pipetpunt te kleven. Pipetteer buffer meerdere malen op en neer voordat het verzamelen van Ifm’s kan maken standaard tips minder kleverig, en Gesiliconiseerde of perfluoroalkoxy (PFA) tips (Zie tabel van materialen) met lagere oppervlaktespanningen kunnen helpen voorkomen dat monsterverlies. 3. IFM dissectie na 48 h APF Monteer de benodigde apparatuur, waaronder twee #5 biologie grade Tang, fijne schaar, standaard glazen Microscoop dia’s, dubbele kleefband, Pipet, pipetpunten, droogijs, en (voor RNA-toepassingen) isolatie reagens (Zie tabel met materialen). Chill de 1x PBS en micro centrifugebuizen op ijs. Breng met een licht bevoste kwast de Klaargezette poppen over naar een strook dubbelzijdige plakband die op een Microscoop-dia is gemonteerd (Figuur 3a). Plaats de poppen in een lijn die gericht is op dezelfde oriëntatie (ventrale naar beneden en voorste naar de onderkant van de glijbaan).Opmerking: Zorg ervoor dat u niet te veel water op het penseel of filter gebruikt, of dat de poppen niet goed blijft plakken. Als de poppen niet vasthouden, droog ze dan eerst naar een droog filter of tissuepapier. Monteer zo veel poppen als kan worden ontleed binnen een 30 min tijdvenster, idealiter ~ 10 poppen. Verwijder de PUPA uit de exuviae-behuizing. Gebruik de tang om uit elkaar te plagen en open het exuviae-hoesje boven de voorste spiracles (Figuur 3B). Schuif een paar Tang dorsaal zachtjes naar het achterste, en snijd de exuviae als de Tang beweegt (Figuur 3B ‘). Let op dat u de onderliggende PUPA niet scheuring. Bevrijd de PUPA van de geopende behuizing en breng deze onmiddellijk over naar een druppel van 1x PBS op een tweede Microscoop glijbaan (Figuur 3B “, C). Herhaal de stappen 3,3 en 3,4 voor alle poppen in de lijn en stel vervolgens de plakband van de dubbele stick opzij. Snijd met behulp van de fijne schaar de buik van de PUPA weg van de thorax en duw deze in een aparte stapel (Figuur 3d, d ‘). Herhaal dit voor de resterende pupae.Opmerking: Begin timing de lengte van dissectie met stap 3,6, zodra exuviae integriteit wordt verstoord. Ontleden zo veel mogelijk vliegen in 20 – 30 minuten om celdood en bijbehorende transcriptomische en proteomische veranderingen te voorkomen. Bij het ontleden van 1 d volwassenen of > 90 h pupae, is het vaak handig voor latere stappen om het hoofd bovendien met de fijne schaar te verwijderen. Verwijder met behulp van een tissuepapier de meerderheid van de 1x PBS (over het algemeen bewolkt met gesuspendeerd vet) en de stapel buikjes (Figuur 3E). Voeg een druppel vers, gekoeld 1x PBS toe aan de overgebleven thoraxes. Gebruik de schaar om de thorax in tweeën te knippen (Figuur 3f, f ‘) door in één beweging van het hoofd naar beneden over de lengteas te snijden. Afwisselend, als de kop is verwijderd, plaats eerst de schaar waar de kop is bevestigd en snijd de bovenste helft van de thorax longitudinaal tussen de IFMs. Snijd vervolgens de ventrale kant van de thorax met een tweede snede in dezelfde richting. Herhaal de stappen 3,7 en 3,8 zodat alle poppen worden ontleed, waardoor een stapel thorax hemisecties in de buurt van het midden van de dia wordt gegenereerd. Zorg ervoor dat er voldoende gekoelde 1x PBS op de glijbaan is, zodat de hemisecties niet uitdrogen.Opmerking: Na 48 h APF zijn de IFMs groot genoeg om zichtbaar te zijn onder een standaard ontsnij Microscoop aan het getrainde oog. Op dit punt in het protocol kunnen spieren met een fluorescerende label worden verplaatst naar een fluorescerende ontsnij ding om te helpen bij IFM-identificatie of voor trainingsdoeleinden, maar dit is niet nodig. Ontleden de IFMs uit de thorax. Isoleer een van de hemisecties met behulp van de #5 Tang (Figuur 3G, H). Voeg voorzichtig de uiteinden van een tang boven en onder het midden van de IFMs in (Figuur 3G ‘, H ‘). Terwijl je de eerste Tang stil houdt, gebruik je een fijne schaar om het ene uiteinde van de IFM weg te knippen van de cuticula en pezen. Snijd vervolgens het andere uiteinde van de IFM vrij van de cuticula (Figuur 3G ‘ ‘, H ‘ ‘).Opmerking: Afhankelijk van de oriëntatie van de thorax na de eerste IFM-Cut, is het handig om de thorax 180 ° te roteren, zodat de tweede IFM-cut gemakkelijker uit te voeren is. Verwijder de IFM-bundel van de thorax met pincet (Figuur 3G ‘ ‘, H ‘ ‘ ‘) en zet deze over naar de rand van de PBS-ballon om de water spanning te gebruiken om deze op zijn plaats te houden (Figuur 3I). Duw het karkas naar de andere kant van de glijbaan. Herhaal dit voor de overgebleven thorax hemisecties, waardoor een verzameling van ontleed IFMs wordt gegenereerd.Opmerking: Als de IFMs niet in een nette stapel blijven, verwijder dan een deel van de 1x PBS met een tissue. Let erop dat u niet alle PBS verdampt en ervoor zorgt dat de ontleed IFMs en hemithoraxes blijven bedekt door buffer. Na het ontleden van alle IFMs, snel een kwaliteitscontrole op de ontleed spier uit te voeren. Gebruik #5 Tang, Verwijder eventuele sprong spieren of cuticula fragmenten die hun weg in het monster hebben kunnen vinden (Figuur 3J-K ‘ ‘).Opmerking: Sprong spier lijkt verschillend van IFM. Als ontleed Mef2-Gal4 gelabeld spier onder fluorescentie, sprong spier heeft een zwakkere fluorescentie en een andere vorm en textuur. Onder normale licht, het lijkt bijna doorschijnend terwijl de IFMs zijn een ondoorzichtige, melkachtig geel (Figuur 3j-j ‘ ‘, K). Met behulp van water spanning, vangen (maar niet squish) de ontleed IFMs tussen een paar van de Tang (Figuur 3L). Breng de IFMs over naar een micro centrifugebuis van 1,5 mL, voorgevuld met 250 μL gekoeld 1x PBS (Figuur 3M). Ga onmiddellijk verder met rubriek 4.Opmerking: Wanneer de Tang-uiteinden in de nabijheid van elkaar worden gebracht en uit een bufferoplossing worden getild, zorgt de water spanning ervoor dat er tussen de Tang-tips een bubbel van buffer wordt gevangen. Als IFMs ook aanwezig zijn in deze bubbel, kunnen ze uit de oplossing worden getild en gemakkelijk worden overgebracht naar een andere met buffer gevulde recipiënt. Het is belangrijk om de Tang te persen om de uiteinden bij elkaar te brengen zonder elkaar aan te raken, om te voorkomen dat het weefsel dat in de buffer ballon wordt gevangen, wordt gemacereert. 4. pellet en conservering van het IFM-monster Pellet de IFMs door de 1,5 mL micro centrifugebuis gedurende 3 – 5 minuten te centrifugeren bij 2.000 x g in een tafel-top centrifuge (Figuur 4a, B). Verwijder de buffer met een pipetpunt (Figuur 4C). Voor RNA-toepassingen, respendeer de IFM-pellet in 50 – 100 μL van de gewenste RNA-isolatie buffer (Zie tabel met materialen, Figuur 4D). Ga anders verder met stap 4,4.Opmerking: IFMs kunnen na stap 4,2 voor massaspectrometrie preparaten of isolatie van RNA met commerciële kits droog worden bevroren (Zie representatieve resultaten). Voor RNA-toepassingen worden betere resultaten verkregen door de IFM-pellet in isolatie buffer onmiddellijk opnieuw op te schorten en te bevriezen. Vries monster op droogijs of klik bevriezen in vloeibare stikstof (Figuur 4E). Bewaren bij-80 °C tot de volgende stappen in de monstervoorbereiding voor downstream-analyse gereed zijn.Opmerking: Na cryopreservation, kunnen monsters worden opgeslagen voor enkele maanden voor de verwerking voor downstream onderzoek.

Representative Results

De hierboven gepresenteerde dissectie protocollen zijn nuttig voor het genereren van IFM-verrijkte monsters van 16 h na de vorming van Puparium (APF) tot het volwassen stadium. Ontleed vlucht spier monsters kunnen worden gebruikt voor meerdere toepassingen, en tot nu toe succesvol zijn toegepast voor RT-PCR4,17, RNA-SEQ16,32, chip36,37, westerse blotting14,41 en massaspectrometrie experimenten (zie hieronder). Om potentiële gebruikers te helpen bij het ontleden van RNA-toepassingen, presenteren we eerst onze resultaten met aandacht voor belangrijke overwegingen specifiek voor isolatie van RNA van IFMs. Om meer in het algemeen het nut van onze dissectie-protocollen te demonstreren, illustreren we een aantal van de mogelijke – omics-toepassingen met behulp van onze gegevens over het RNA-bindende proteïne Bruno1. IFM dissectie protocol levert hoge kwaliteit RNA Het is belangrijk om te bepalen van het aantal vliegen van tevoren worden ontleed, als codering mRNA wordt geschat op slechts 1 – 5% van totaal RNA42. We verkregen gemiddeld 24 ± 9 ng van het totale RNA per vliegtuig van IFM uit 1 d volwassenen (Figuur 4F en aanvullend figuur 1a), met rendementen die meestal toenemen met ervaring. Dit rendement van totaal RNA per vliegtuig is relatief constant, schommelend rond 25 ng voor IFM ontleed bij 16 h APF, 24 h APF, 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF en 90 h APF (Figuur 4F en aanvullende figuur 1b, D, E). Deze waarnemingen weerspiegelen ook elk RNA dat geïsoleerd is van contaminerende vetten, pees, luchtpijp of andere celtypen, die hoger kunnen zijn in monsters die geïsoleerd zijn van eerdere tijdpunten. Zo verkregen we > 1 μg totaal RNA van IFM van 50 vliegen en meestal ontleden IFM van 100 − 150 vliegt naar het genereren van > 3 μg totaal RNA voor RNA-SEQ monsters. De methode van RNA-isolatie beïnvloedt de kwantiteit en kwaliteit van hersteld RNA, en we moedigen gebruikers aan om hun isolatie benadering te valideren. Terwijl isolatie met methode 1 bijvoorbeeld gemiddeld 1143 ± 465 ng van het totale RNA van IFM oplevert van 50 1 d volwassen vliegen, levert isolatie met verschillende commerciële kits overal van 186 ± 8 ng tot 1261 ± 355 ng van totaal RNA (Figuur 4G en Aanvullend cijfer 1C). RNA geïsoleerd van commerciële kits is over het algemeen van goede kwaliteit (Figuur 4H en aanvullende Figuur 1f), maar lage terugvorderingen suggereren dat RNA niet efficiënt kan worden geellueerd uit de kolommen. RNA-integriteit kan ook worden aangetast door het gebruik van een kit zoals gedaan in methode 2 (Figuur 4H, tweede plot), waarschijnlijk als gevolg van buffer constitutie en hitte behandelingen, wat leidt tot ernstige fragmentatie die van invloed kan zijn op downstream experimenten. Het is ook belangrijk om de juiste RNase-vrije techniek te observeren bij het isoleren en hanteren van RNA-monsters. Hoewel vries-dooi cycli en een 4 h kamertemperatuur incubatie geen dramatische invloed hebben op RNA-integriteits profielen, leiden zelfs kleine hoeveelheden RNase tot snelle RNA-degradatie (Figuur 4I en aanvullende methoden). Gebruikers worden nog steeds aangemoedigd om te werken op ijs en te beperken bevriezen-ontdooien om te voorkomen dat RNA hydrolyse en fragmentatie. Dit werd hier niet gedetecteerd, maar het voorkomen van RNase besmetting met behulp van filter tips en DEPC-behandelde buffers is absoluut noodzakelijk. De efficiëntie van reverse transcriptie heeft ook invloed op het succes van downstreamtoepassingen. We hebben betrouwbare resultaten behaald met twee van de drie commerciële RT-kits die we hebben getest, die beide sterke RT-PCR-bands versterken voor het ribosomale gen rp49 (Figuur 4J). RT Kit #2 kan echter gevoeliger zijn voor de detectie van laag-uitgedrukt transcripten, omdat we sterkere banden hebben verkregen voor het RNA-bindende proteïne bru1 voor alle drie de biologische replicaten (Figuur 4J). Tezamen tonen deze resultaten aan dat RNA van hoge kwaliteit kan worden geïsoleerd van IFMs die met deze procedure worden ontleed. Ontleed IFMS produceren hoge kwaliteit mRNA-SEQ en proteomica gegevens Met behulp van IFM ontleed volgens het bovenstaande protocol bij 30 h APF, 72 h APF en van 1 d volwassen vliegen, we eerder aangetoond dat de RNA-bindende proteïne en CELF1-homologue Bruno1 (Bru1, arrestatie, Aret) bestuurt een IFM-specifieke splicing traject stroomafwaarts van de transcriptiefactor Spalt Major (Salm)16. IFMS van Null mutanten evenals vliegen met muscle-specifieke bruno1 RNAi (bru1-IR) display sarcomere groei defecten, misregulatie van myosin activiteit en uiteindelijk Hyper contractie en verlies van spiervezels16,17 . Hieronder demonstreren we het nut van ontleed IFMS voor hele Proteoom massaspectrometrie en laten zien dat verschillende van de expressie veranderingen die we op het RNA-niveau hebben waargenomen, ook duidelijk zijn op het eiwit niveau. We wijzen verder op een specifiek ontwikkelings-Splice-evenement in MHC dat gereguleerd werd door Bruno1, ter illustratie dat mRNA-SEQ en RT-PCR van ontleed IFMS kunnen worden gebruikt om de regulering van alternatieve Splice-gebeurtenissen aan te tonen. Afhankelijk van de kwaliteit en diepte van de bibliotheek, kunnen mRNA-SEQ-gegevens worden geanalyseerd op het niveau van geneenheden (gemiddelde Lees tellingen over alle exonen van een gen), individuele exonen of Splice-kruisingen. mRNA-SEQ-gegevens van bru1-IR IFMS in vergelijking met wild type toont zwakke veranderingen in expressie op de genunit niveau16 (Figuur 5A). Bij 72 h APF, er is al een trend voor sarcomere genen zoals spier LIM eiwit op 60A [Mlp60A], actine 57B [Act57B], spier-specifieke eiwit 300 kDa [Msp300], of Stretchin-Mlck [Strn-Mlck]) die belangrijk zijn voor de juiste spierontwikkeling te worden gedowngereguleerd in bru1-IR- spier (Figuur 5A en aanvullende tabel 1). We hebben echter eerder aangetoond dat er op het niveau van individuele exonen een veel sterkere Downregulatie is van specifieke sarcomere Gene isovormen16, wat suggereert dat de belangrijkste functie van Bruno1 is om alternatieve splicing te regelen (aanvullende tabel 1 ). Met behulp van Whole-proteome massaspectrometrie op ontleed IFMs, kunnen we vergelijkbare regulering op het eiwit niveau (Figuur 5B en aanvullende tabel 2) tonen. Van de 1.895 peptide groepen gedetecteerd, 524 (28%) van hen zijn verkeerd gereguleerd in Bru1m2 Mutant IFM in 1 d volwassenen (aanvullende tabel 2). Downregulatie van zowel Strn-Mlck en Mlp60A eiwit wordt ook waargenomen, overeenkomende waarnemingen op het transcript niveau in onze mRNA-SEQ gegevens. Ondanks het beperkte aantal database peptiden die worden toegewezen aan specifieke eiwit isovormen (Zie aanvullende methoden voor analyse details), voor sarcomere eiwitten tropomyosin 1 (Tm1), toegewezen (up/TNT), MHC, gebogen (BT/Projectin) en paramyosin (PRM) we Observeer opregulatie van peptiden uit één isovorm en Downregulatie van een ander (Figuur 5B), waarbij onze eerdere observaties van vergelijkbare verordening op het RNA-niveau16worden bevestigd. Dit toont aan dat ontleed IFMS nuttig zijn voor zowel mRNA-SEQ en proteomica toepassingen. Als een ander voorbeeld van hoe omics-gegevens een aanvulling kunnen zijn op traditionele benaderingen om biologisch inzicht te verbeteren en uit te breiden, hebben we ervoor gekozen om ons te concentreren op splicing bij het C-Terminus van MHC. Een eerder gekarakteriseerde proteïne-vallijn genaamd weeP26 wordt ingevoegd in het uiteindelijke intron van MHC43,44 (Zie aanvullende methoden voor exacte locatie). weeP26 bevat een sterke Splice acceptor en is opgenomen in vermoedelijk alle MHC transcripten (Figuur 5C). De GFP met het label proteïne in IFM is echter opgenomen in twee “stippen” aan beide zijden van de M-lijn, terwijl in de been spier, het uniform over de M-lijn en zwak over de dikke filamenten (Figuur 5E). Orfanos en Sparrow toonden deze “stippen” in IFM-vorm als gevolg van een ontwikkelings- MHC isovorm schakelaar: de MHC isovorm uitgedrukt vóór 48 h APF is GFP-gelabeld als de weeP26 Exon inserts in het open Lees frame, terwijl de MHC isovorm, uitgedrukt na 48 h APF is niet gelabeld, aangezien de weeP26 Exon stroomafwaarts van de stop codon in de 3 ‘-UTR44is opgenomen. Onze mRNA-SEQ-gegevens lieten ons toe om C-Terminal MHC isovorm-expressie in meer detail te karakteriseren. Hoewel er twee verschillende MHC -afsluitingen zijn gerapporteerd43,44, suggereren onze mRNA-SEQ-gegevens en huidige flybase-aantekening (FB2019_02) dat er in feite drie mogelijke alternatieve Splice-gebeurtenissen zijn op de MHC C-Terminus (Exon 34-35, 34-36 of 34-37) (Figuur 5C), die wordt bevestigd door RT-PCR (Figuur 5D). weeP26 GFP wordt ingevoegd in het intron tussen Exon 36 en 37; Aangezien zowel Exon 34-35 als Exon 34-36 isovormen stop Codons bevatten, kan GFP alleen worden vertaald in Exon 34-37 isovorm (resulterend in Exon 34-GFP-37). Verder konden we zowel de temporele als de ruimtelijke regulering van alle MHC -isoforms zien. In IFM observeren we een MHC isovorm schakelaar van Exon 34-37 naar Exon 34-35 tussen 30 h APF en 48 h APF (Figuur 5C, D, F) bij 27 °c, ook al is dit nog niet zichtbaar door immunofluorescentie bij 48 h APF (Figuur 5E). Legs uiten al een mengsel van Exon 34-37 en Exon 34-35 bij 30 h APF, en door 72 h APF Express alle drie de MHC -isovormen (Figuur 5D, F). Volwassen sprong spier (TDT) drukt ook alle drie MHC isovormen (Figuur 5F), wat suggereert dat dit is over het algemeen waar voor buisvormige somatische spieren. Zo kunnen onze mRNA-SEQ-gegevens uitbreiding van eerdere bevindingen door het tijdsbestek voor de MHC isovorm-schakelaar in IFM te verkleinen en het gebruik van MHC -isovorm in buisvormige spieren te karakteriseren. MHC isovorm-verordening in Salm en bru1 Mutant IFM werden vervolgens onderzocht. In beide gevallen zagen we een misregulering van weeP26. Salm Mutante IFMS voltooien de ontwikkelings schakelaar in MHC isovorm expressie en fenocopiesyndromen leg splicing patronen in latere stadia, inclusief Gain van het exon 34-36 Event (Figuur 5F). Dit stemt overeen met eerdere bevindingen dat verlies van Salm resulteert in een near-complete Fate transformatie van IFM naar tubulaire spier16. Bru1-IR en Bru1 Mutant IFM, vergelijkbaar met Salm-/- IFM, behoudt het exon 34-37 Splice Event door middel van volwassen stadia (Figuur 5E, F), resulterend in een weeP26 GFP etiketteer patroon dat lijkt op been spier, maar het wint niet het exon 34-36 Event. Dit suggereert dat Bruno1 nodig is in IFM om ten minste gedeeltelijk de ontwikkelings schakelaar in MHC alternatieve splicing te controleren, maar het geeft aan dat extra splicing factoren ook verkeerd gereguleerd zijn in de Salm-/-context. Bovendien illustreert dit voorbeeld hoe RT-PCR-en mRNA-SEQ-gegevens van ontleed IFM waardevol kunnen zijn bij het verkrijgen van een dieper inzicht in ontwikkelings splicing-mechanismen en waargenomen morfologische defecten. Figuur 1: IFM ontwikkeling en enscenering van pupae. A) Schematische weergave van de IFM-ontwikkeling bij 24 h apf, 32 h apf, 48 h apf, 72 h APF en 1 d volwassenen die compactie van vlucht spieren (groen) tonen bij ~ 32 h APF en daaropvolgende vezel groei om de thorax te vullen. Pezen zijn in donkergrijs. B) confocale beelden van vaste ifm’s uit open boek dissecties (24 uur, 32 u, 48 h)19 of thorax hemisecties (72 h, 1 dag) gekleurd voor actine (Rhodamine phalloidin, magenta) en GFP (groen). (C, D) Afbeeldingen van GFP-fluorescentie in levende poppen die de intacte IFM-morfologie van de dissectie-Fly-lijn in het dorsale (C) of laterale (D) vlak illustreren. Asterisken Mark IFM locatie. E) voor de voorbereiding op dissecties moeten vlieg voorraden worden gespiegeld of kruisen die 3 – 4 dagen van tevoren worden ingesteld. F) de prepupae worden geselecteerd door hun witte kleur (gele pijlpunten) en geïsoleerd met een bevoafd penseel (f ‘, f ‘ ‘). G) de prepupae moet worden gesexed om vrouwtjes van mannetjes te scheiden op basis van de aanwezigheid van testes die als posteriorly zijn gelegen doorschijnende ballen (gele sterretjes). H) de pupae zijn gerijpt op bevoafd filtreerpapier in gerechten van 60 mm. Schaal staven = 100 μm (B), 1 cm (C, D, E, H), 1 mm (F, F ‘ ‘, G). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 2: dissectie van ifms vóór 48 h APF. A) toevoegingvan 1x PBS-buffer aan een zwarte ontleden-schotel met een pipet voor overdracht. B) overdracht van Klaargezette poppen met behulp van een penseel. (C) onder een fluorescerende ontsnij Microscoop om GFP te visualiseren, zachtjes duwen van de PUPA naar de bodem van een dissectie schotel met behulp van #5 Tang (geschetst in grijs). De “X” in een cirkel duidt beweging in de afbeelding aan. (D, E) Het grijpen van de poppen anterieure (D), en vervolgens het poelen van de poppen net achter de thorax (E). Streepje in een cirkel duidt geen beweging aan. (F, G) Trekken met de voorste Tang (pijl) om de exuviae-kast (F) te verwijderen en vervolgens de buik te verwijderen (G). H) herhaling van C-G voor verschillende PUPA. Gele stippellijnen zijn genummerd en dragen bij aan het bijdragen aan de pupae. (I, J) Gebruik van de Tang (I) om IFMs te isoleren van het omringende weefsel (J). Stip in een cirkel geeft beweging uit de pagina aan. (K, L) Verwijdering van verontreinigingen inclusief vet en sprong (TDT) spieren (K) voor het genereren van een schone IFM monster (L). TDT heeft een lagere GFP-expressie en een andere vorm dan IFM-vezels (K ‘). (M, N, O) Gebruik van een geknipte pipetpunt (M) voor het verzamelen van ontleed IFMs (N) en de overdracht ervan naar een microcentrifuge buis (O). Schaal staven = 1 cm (A, B, M, O), 1 mm (C-G), 500 μm (H-L, N). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 3: dissectie van ifms na 48 h APF. A) het uitlijnen van de poppen op de dubbele kleefband. B) het verwijderen van de poppen uit de exuviae-zaak door het openen van anterieure (b), het snijden van de zaak schrapen (b ‘) en het opheffen van de PUPA (b ‘ ‘). Cirkel symbolen vertegenwoordigen hetzelfde als Figuur 2. C) overdracht van de poppen naar de buffer. D) verwijdering van de buik door het snijden met een schaar (gele dubbele pijlen) en scheiding van Thoraxes (d ‘). (E, F) Toevoeging van schone buffer (E), vervolgens snijden van thoraxes in de helft longitudinaal (f, f ‘). (G, H) Dissecties kunnen worden uitgevoerd onder wit licht (G) of fluorescentie om de GFP (H) te visualiseren; het snijden van de IFMs aan één zijde (G ‘), dan de andere zijde (G ‘ ‘); het opheffen van de thorax met een tang (aangegeven in grijs) (G ‘ ‘). (I, J, K) Verzameling van IFMs in buffer (I) en verwijdering van verontreinigend ventrale zenuw koord (VNC), gut en sprong spier (TDT) (J) om een schoon IFM-monster (K) te genereren. TDT heeft een lagere GFP-expressie en een andere vorm dan IFM-vezels (J ‘ ‘, K ‘). (L, M) Gebruik van een tang om IFMs (L) over te brengen naar een micro centrifugebuis (M). Schaal staven = 1 cm (A, E, M), 1 mm (B-D ‘, F-L). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 4: IFM-CONSERVERING en RNA-isolatie Details. A) de IFMS worden gepelleteerd door centrifugeren gedurende 5 min bij 2000 x g. B) IFM-pellet (pijl) en pellet onder fluorescentie (b ‘). C) verwijderen van alle buffer met een pipetpunt. D) voor RNA-extractie, resuspensie van pellet in isolatie buffer. Deze stap kan worden overgeslagen om te drogen-bevriezen ontleed IFMs. E) bevriezing van monster in vloeibare stikstof of op droogijs en opslag bij-80 °c. Schaal staven = 10 cm (A), 1 mm (B, B ‘), 1 cm (C, D, E). F) nano grammen (ng) van totaal RNA van ONTLEED IFM per vliegtuig bij 16 h APF, 24 h APF, 30 h apf, 48 h apf, 72 h apf, 90 h APF, en 1 d volwassene. Foutbalken = SD. (G) totaal RNA geïsoleerd van IFM ontleed van 50 1 d volwassen vliegen met behulp van verschillende extractiemethoden. Foutbalken = SD. (H) representatieve sporen om RNA-integriteit na verschillende extractiemethoden te testen. De ribosomale banden lopen net onder 2000 nucleotiden (NT) en de marker band op 25 NT. aanvullende sporen beschikbaar in aanvullende figuur 1. I) representatieve sporen van een vers geïsoleerd RNA-monster (boven), een monster gevriesdroogde 25x op droogijs (tweede perceel), een monster dat op de Bank is achtergelaten voor 4 uur (derde perceel), en een monster dat is behandeld met RNase a (bodem perceel). Opmerking volledige afbraak van RNA bij toevoeging van RNase A. (J) RT-PCR-gel van kits als gelabeld voor bru1 en rp49. De relatieve intensiteit van de bru1 band genormaliseerd tegen rp49 wordt hieronder uitgezet. Foutbalken = SEM (niet-gekoppelde t-toets, p = 0,0119). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 5: toepassing van IFM-dissecties om Bruno1 functie in alternatieve splicing te onderzoeken. A) vulkaan plot van mRNA-SEQ-gegevens (geneenheid) van IFMS ontleed bij 72 h APF. Genen die significant worden gereguleerd tussen bru1-IR en wild type IFM (padj < 0,05, ABS (Log2FC) > 1.5) worden weergegeven in blauw en niet-significante genen in grijs. Sarcomere eiwitten worden rood gemarkeerd en bepaalde genen worden gelabeld. B) vulkaan plot van hele Proteoom massaspectrometrie resultaten van 1 d volwassen IFMS. Eiwitten sterk verschillend tussen BRUm2mutanten en wild type (FDR < 0,05) worden weergegeven in blauw, niet-significante eiwitten in grijs. Sarcomerische eiwitten zijn rood gemarkeerd. Peptiden overeenkomend met genen in (A) zijn gelabeld in het rood. Sets van peptiden mapping naar verschillende isovormen van hetzelfde eiwit zijn gelabeld in dezelfde kleur. C) schema van het C-eindpunt van MHC , ter illustratie van verschillende transcript isovormen en plaatsings locatie van de weeP26 Genval (Zie aanvullende methoden voor invoegpositie). RT-PCR-primers worden aangeduid als zwarte lijnen boven transcripten. Lees aantallen per kilo base per miljoen basissen (rpkm) van mRNA-SEQ worden weergegeven voor IFMS uit het wild type bij 30 h APF (oranje) en 72 h APF (rood), van bru1-IR (blauw) en Salm-/- (cyaan) bij 72 h APF en van het hele been (groen) bij 72 h APF . D) RT-PCR met primers tegen MHC met de isovorm-schakelaar in IFM tussen 30 uur APF en latere tijdpunten. Het exon 34-35 Splice event is slechts zwak waargenomen in BRUM3Mutant IFM of in het volwassen been. (E) confocale beelden van weeP26 GFP lokalisatie in wild type IFM sarcomeres op 48 h APF en 90 h apf in vergelijking met 90 h APF been spier. Schaal staven = 1 μm.F) afsplitsing van de Splice-junctie van mRNA-SEQ-gegevens voor genotypen en tijdpunten als gelabeld. Junctie-leesbewerkingen worden gepresenteerd als de verhouding van een specifiek Splice-evenement (Exon 34 tot 35 in grijs, 34 tot 36 in paars, en 34 tot 37 in het groen) tot het totale aantal gebeurtenissen die de Exon 34 Splice-donor delen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Aanvullend figuur 1: (a, B, C) RNA opbrengsten uit monsters van hetzelfde genotype die in dezelfde week door dezelfde onderzoeker zijn ontleed. Nadat alle monsters werden ontleed, werd RNA geïsoleerd en gemeten op dezelfde dag. A) nano grammen (ng) van totaal RNA verkregen uit IFM-dissecties per 1 d volwassen vlieg. Foutbalken = SEM. (B) totaal RNA verkregen uit ontleed IFM per vlucht bij 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF en 1 d volwassene. C) totaal RNA geïsoleerd van IFM uit 50 1 d volwassen vliegen met behulp van verschillende extractiemethoden. D) totale RNA-concentraties per vlucht van ontleed benen, sprong spier (TDT) en IFM. Meer RNA wordt verkregen uit de grotere IFMs. Foutbalken = SD. (E) totale RNA-concentraties per fly van IFM uit de controles vergeleken met RNAi-of Mutante monsters bij 30 h APF, 72 h APF en 1 d volwassene. Voor mutanten, w1118 werd gebruikt als wild type controle. Mutant data zijn samengesteld uit bru1-IR, Salm-/- en een andere RNA-bindende proteïne mutant. Merk op dat voor deze manipulaties, RNA-opbrengsten worden verlaagd in 1 d volwassen als gevolg van spieratrofie en verlies, dus meer vliegen moeten worden ontleed om voldoende hoeveelheden voor omics benaderingen te verkrijgen. Fouten balken = SD. (F) extra sporen die de RNA-integriteit vertonen voor de RNA-isolatie methoden weergegeven in Figuur 4G en in aanvullend figuur 1c. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Aanvullende methoden: Een gedetailleerde beschrijving van de in de gehele tekst gebruikte methoden en reagentia, en met name voor het genereren van de gegevens in Figuur 1A-D, Figuur 4F-K, Figuur 5, aanvullende tabel 1, en Aanvullende tabel 2. Deze gegevens motiveren het dissectie protocol en demonstreren het nut ervan voor RNA-isolatie, mRNA-seq, RT-PCR en Proteomics. Klik hier om dit bestand te downloaden. Gerelateerd aan figuur 5 en bijbehorende alinea’s in de hoofdtekst Naam van tabblad Gegevens samenvatting Sarcomere eiwitten Lijst van sarcomere genen van Spletter et al. Elife 2018; Hier vermelden we de huidige FBgn en gennaam. SP Gene units_DESeq2_72h Met behulp van gegevens uit Spletter et al. EMBO rep 2015, keken we specifiek naar de sarcomere-genen in de mRNA-SEQ-gegevens bij 72 h APF. Dit komt uit de DESeq2-analyse die differentiële expressie op het niveau van de geneenheid tussen controle (Mef2-Gal4, UAS-GFM-GMA gekruist naar w1118) en Mef2-Gal4, UAS-GFM-GMA x Bruno1-IR detecteert. In geel gemarkeerde rijen zijn bewegwijzerdelijk omhoog of omlaag gereguleerde genen (boven/onder een drempel van log2FC = ABS (1.5)). Deze gegevens zijn de Red Dot-overlay in afbeelding 5A. Voor elk sarcomere-gen geven we id-informatie, de log2FC van DESeq2, P-waarde en aangepaste P-waarde, evenals DESeq2 genormaliseerde expressie tellingen. SP exon_DEXSeq_72h Met behulp van gegevens uit Spletter et al. EMBO rep 2015, hebben we specifiek gekeken naar sarcomere Gene Exon gebruik in de mRNA-SEQ-gegevens bij 72 h APF. Dit komt uit de DEXSeq-analyse die differentieel Exon gebruik tussen besturing (Mef2-Gal4, UAS-GFM-GMA gekruist naar w1118) en Mef2-Gal4, UAS-GFM-GMA x Bruno1-IR detecteert. In geel gemarkeerde rijen zijn bewegwijzerdelijk omhoog of omlaag gereguleerde exonen (boven/onder een drempel van log2FC = ABS (1.5)). We verstrekken Exon-en Gene Identifier-informatie, de log2FC van DEXSeq, P-waarde en aangepaste P-waarde, evenals een lijst van bijbehorende transcripten. Houd er rekening mee dat veel genen de regulering van een of meer exonen in de DEXSeq-analyse laten zien, vaak met hoge log2FC waarden en lage P-waarden/ADJUST P-waarde, terwijl een beperkte lijst met genen wijzigingen vertoont op 72 h APF. Dit ondersteunt een sterk effect van het verlies van Bruno op de regulering van alternatieve splicing. Aanvullende tabel 1: tabel van 72 h APF mRNA-SEQ gegevens voor sarcomere eiwitten identificeren van differentiaal uitgedrukte genen (via DESeq2) en Exonen (via dexseq) in bru1-IR versuswild type IFMS. Gerelateerd aan figuur 5B en bijbehorende alinea’s in de hoofdtekst Naam van tabblad Gegevens samenvatting Perseus-uitgang Dit is een verwerkte data sheet met de massaspectrometrie gegevens die worden gebruikt om figuur 5B te genereren. IFM samples zijn van 1 d Adult Control (w1118) en Mutant (bruno1-m2) vliegen. Belangrijke kolommen zijn de getransformeerde intensiteitswaarden voor elk van de 4 replicaties voor elk monster, de statistiek en significantie van t-toets, peptide-Id’s en bijbehorende gennamen en Flybase-Id’s. Signifance werd berekend met behulp van standaardinstellingen in Perseus (FDR <. 05). Er zijn 1859 eiwitten/peptiden gedetecteerd, waarvan 524 (28%) tussen de monsters aanzienlijk verschillen. Werden Dit zijn alle 252 eiwitten/peptiden uit de Perseus-output die worden gedowngereguleerd in bruno1-m2 Mutant IFM. Omdat de Flybase-Id’s en gennamen verouderd zijn, bieden we ook de huidige Flybase-gen-ID en gennaam aan. Upregulated Dit zijn alle 272 eiwitten/peptiden uit de Perseus-output die upregulated zijn in bruno1-m2 Mutant IFM. Omdat de Flybase-Id’s en gennamen verouderd zijn, bieden we ook de huidige Flybase-gen-ID en gennaam aan. Houd er rekening mee dat de sarcomere eiwitten rood gemarkeerd in figuur 5B aanwezig zijn in de bovenstaande lijsten. De lijst van genen die worden beschouwd als onderdeel van de sarcomere is beschikbaar op een van de tabbladen in aanvullende tabel 1. Aanvullende tabel 2: tabel van hele Proteoom Mass-spectrometrie gegevens van 1 d volwassen identificatie van differentieel uitgedrukt eiwitten en eiwit isovormen in BRUm2Mutant VS. wild type IFMs.

Discussion

In dit protocol presenteren we de basistechniek om Drosophila IFMS te ontleden van vroeg-en laat stadium-poppen voor downstream isolatie van eiwitten, DNA, RNA of andere macromoleculen. Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan ontleden IFM van volwassen vliegen. We demonstreren het nut van ons dissectie-protocol voor mRNA-seq-, proteomica-en RT-PCR-toepassingen. Met de voortdurende verbetering van Omics-technologieën om analyses van monsters met minder startmateriaal en lagere ingangs concentraties mogelijk te maken, zullen deze dissecties waarschijnlijk waardevol zijn voor veel extra toepassingen. Aangezien ifm’s een vastgesteld model zijn voor humane myopathieën4,24 en specifieke ontwikkeling van het spier type9,12, zijn we voorbeeld, bijvoorbeeld IFM-verrijkte metabolomics, onderzoeken naar chromatine-conformatie via 3C of 4C, splicing netwerk evaluatie via CLiP interacties of fosho-Proteomics van myofibrillogenesis.

Het is belangrijk te bedenken dat deze dissecties een voorbeeld verrijkt voor IFM produceren in plaats van een puur IFM-monster. Dit is onvermijdelijk als gevolg van motorische neuron innervation, pees bijlagen en tracheale invasie van spiervezels. Bioinformatica analyse kan worden gebruikt om IFM-verrijkte genen of eiwitten te identificeren, maar verdere experimenten zijn nodig om aan te tonen dat ze in feite IFM-specifiek zijn. De zuiverheid van het monster kan worden getest met gepubliceerde Weefselspecifieke markers zoals Stripe45 (pees), Act79B4,44 (tubulaire spier), Act88F15 (IFM) of Syb46 (neuronale specifieke). Het kan mogelijk zijn om dergelijke markers te gebruiken om gegevenssets te normaliseren naar de IFM-specifieke inhoud, maar gebruikers worden gewaarschuwd dat temporele veranderingen in de uitdrukking van genen die worden gebruikt voor normalisatie, bijvoorbeeld van IFM-specifieke genen of tubulin, een dergelijke benadering kunnen bias.

Genetisch gecodeerde Weefselspecifieke etiketterings methoden, zoals EC-tagging47,48 of pabp-labeling49,50 voor het isoleren van RNA zijn de afgelopen jaren ontwikkeld, wat kan helpen om een echt weefsel-specifieke RNA monster. Echter, EC-tagging vereist constante voeding van vliegen47 en is dus niet toepasbaar tijdens exuviae stadia. De gevoeligheid en volledigheid van PABP-gelabelde transcriptomes kan beperkingen51hebben. FACS benaderingen om individuele spiervezels te isoleren worden gecompliceerd door de grote omvang en syncytiële aard van IFMs. INTACT52,53 stijl benaderingen kunnen worden toegepast om specifieke subcellulaire compartimenten van IFMS te isoleren, wat nuttig kan blijken voor het isoleren van zuivere populaties van IFM-kernen of mitochondriën. Handmatige dissecties zijn nog steeds de huidige standaard om intact IFM-weefsel te verkrijgen voor de meeste downstreamtoepassingen.

De kwaliteit van het monster is afhankelijk van een aantal kritieke stappen in het dissectie proces. De dissecties zijn technisch veeleisend, met dissectie snelheid en monster zuiverheid verhogen met ervaring. Ontleden voor korte perioden (20 – 30 min) in gekoelde buffer zonder afwasmiddel en onmiddellijk invriezen helpt om de integriteit van het monster te behouden, zoals eerder is waargenomen voor muis pees isolatie54. IFMs kunnen met succes droog worden bevroren na het verwijderen van alle buffer uit de pellet, maar specifiek voor RNA-isolatie, de bevriezing van monsters in isolatie buffer neigt tot betere resultaten te produceren. IFMS van maximaal 20 afzonderlijke dissecties worden voorafgaand aan RNA-of eiwit-isolatie gecombineerd, waardoor opschalen en voldoende materiaal kan worden verzameld, zelfs vanaf vroege tijdpunten of mutanten16,32, voor downstream-analyse.

Voor RNA-toepassingen kan de meest kritieke stap de isolatie van het RNA zelf zijn. Guanidinium thiocyanate-fenol-chloroform isolatie (methode 1 hierboven) overtreft de meeste commerciële kits getest en, zoals eerder opgemerkt, is aanzienlijk minder duur55. De variabiliteit waargenomen in RNA-isolatie opbrengsten met commerciële kits is in overeenstemming met eerdere observaties56,57. We voegen verder glycogeen toe tijdens de precipitatie van isopropanol om alle RNA te helpen herstellen. Naast RNA-opbrengst is het belangrijk om de RNA-integriteit te controleren om ervoor te zorgen dat het monster niet gefragmenteerd of afgebroken is tijdens de dissectie-en isolatie processen. Het is ook essentieel om RNase-vrij te werken. Ten slotte kan de keuze van de RT-Kit invloed hebben op de gevoeligheid van het omgekeerde transcriptie proces. Hoewel ze niet vaak gedetailleerd worden besproken, hebben al deze punten invloed op de kwaliteit van het IFM-monster en de gegevens die worden verkregen uit downstreamtoepassingen.

Verschillende belangrijke wijzigingen stellen het protocol naast bestaande IFM-dissectie protocollen. Hoewel een gedetailleerd dissectie protocol voor IFM immunofluorescentie bestaat19, presenteert dit protocol een andere benadering van exuviae dissecties die een snellere isolatie van IFM-weefsel mogelijk maakt. Dit maakt het verzamelen van grote hoeveelheden IFM weefsel (relatief gesproken) met beperkte dissectie tijden om te voorkomen dat Proteoom of transcriptome veranderingen. Andere protocollen beschrijven dissectie van volwassen IFM voor het visualiseren van GFP-kleuring in individuele myofibrillen39 of voor het kleuring van larvale Body-Wall-spieren58, maar ze hebben geen betrekking op dissectie op exuviae-stadia of op isolatie van RNA of eiwitten. Deze aanpak verschilt ook van het bestaande protocol voor micro dissectie van exuviae IFMS van cryosecties38, die een zuiverder IFM-monster kan genereren, maar meer arbeidsintensief is en minder materiaal produceert. In vergelijking met andere Rapid Adult IFM dissectie protocollen38,39, zijn IFMS geïsoleerd in PBS-buffer zonder reinigingsmiddel om stress inductie en andere belangrijke veranderingen in de expressie te beperken.

De belangrijkste voorschot in dit protocol is de opname van een live, fluorescerende Reporter, waardoor isolatie van de IFMS in vroege exuviae stadia. We gebruiken standaard Mef2-GAL459 rijden ofwel UAS-CD8:: GFP of UAS-GFP:: GMA60. Dit maakt differentiële etikettering van IFM mogelijk (vlucht spieren zijn krachtiger gelabeld en verschillend gevormd dan andere exuviae-spieren), evenals prestaties van GAL4-UAS-gebaseerde manipulaties, bijvoorbeeld reddingsoperaties of RNAi-experimenten. Het is ook mogelijk om Mef2-GAL4 te combineren met tub-GAL80TS om RNAi-geassocieerde vroege letaliteit of met UAS-Dcr2 te vermijden om RNAi-efficiëntie40te verhogen.

Er zijn extra GAL4 drivers of GFP-lijnen beschikbaar die variëren in spier-type specificiteit, temporale expressie patroon, en de sterkte van de bestuurder19,61 die kunnen worden gebruikt in plaats van Mef2-GAL4. Bijvoorbeeld, Act88F-GAL4 wordt voor het eerst uitgedrukt rond 24 h APF, dus het kan niet worden gebruikt voor eerdere tijdpunten; echter, het sterk Etiquette IFM en kan nuttig zijn om te voorkomen dat RNAi-geassocieerde vroege letaliteit. Hem-GFP of Act88F-GFP label IFM, opnieuw met tijdelijke beperkingen, maar ze vermijden GAL4 afhankelijkheid van marker expressie en kunnen nuttig zijn in combinatie met een mutant achtergrond van belang. Lijsten van andere mogelijke markeringslijnen zijn beschikbaar19. Er moet ook worden opgemerkt dat het gebruik van transgenen en het GAL4/UAS-systeem genexpressie artefacten kan veroorzaken, dus het is belangrijk om geschikte controles te gebruiken, bijvoorbeeld de driver lijn die wordt doorkruist naar de wild-type achtergrond stam, zodat dergelijke artefacten vermoedelijk hetzelfde in alle samples.

Met de begeleidende video, dit gedetailleerde protocol is bedoeld om exuviae IFM dissectie toegankelijker te maken en te bevorderen het gebruik van omics benaderingen om spierontwikkeling te bestuderen. Het koppelen van de kracht van Drosophila genetica en celbiologie met de biochemie en omics assays toegankelijk via ONTLEED IFM heeft het potentieel om het mechanistische begrip van myogenese en spierfunctie te verbeteren. Toekomstige studies die systemen-niveau observaties van transcriptome en Proteoom regulatie koppelen aan metabole en functionele outputs zullen een dieper inzicht geven in spier-type specifieke ontwikkeling en de pathogenese van spieraandoeningen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We zijn Andreas Ladurner en Frank Schnorrer dankbaar voor hun ruime steun. We danken Sandra Esser voor de uitstekende technische assistentie en Akanksha Roy voor het genereren van de Mass spectrometrie data. We erkennen de voorraad centra van Bloomington en Vienna voor het leveren van vliegen. We danken de kern faciliteit Bioimaging voor hulp bij confocale beeldvorming en de Zentrallabor für Proteinanalytik voor analyse van massaspectrometrie monsters, zowel in het LMU Biomedical Center (Martinsried, DE). Ons werk werd gesteund door de Deutsche Forschungs Gemeinschaft (MLS, SP 1662/3-1), het centrum voor geïntegreerde proteïne Science Munich (CIPSM) aan de Ludwig-Maximilians-Universiteit München (MLS), de Frederich-Bauer Stiftung (MLS), en de internationale Max Planck Research School (EN).

Materials

5x High Fidelity (HF) buffer Thermo Fisher F518L
60 mm culture dishes Sigma-Aldrich Z643084-600EA Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented
black dissecting dish (glass) Augusta Laborbedarf 42021010 Lymphbecken, black glass, 4×4 cm
black silicon dissecting dishes: activated charcoal powder Sigma-Aldrich C9157 Also available from most pharmacies
black silicon dissecting dishes: Sylgard 184 Sigma-Aldrich 761036 Dishes are made by mixing the Sylgard (~50g) with activated charcoal powder (200 mg) and curing it in Petri dishes (~4 60 mm dishes).
blue pestle Sigma-Aldrich Z359947-100EA Any pellet pestle that can sterilized, also can be used with a motor-driven grinder
cell phone camera, Samsung Galaxy S9 Samsung SM-G960F/DS used for photos not taken under a microscope
chloroform PanReac AppliChem A3691,0500
confocal microscope, Leica SP8X upright confocal Leica www.leica-microsystems.com
confocal microscope, Zeiss LSM 780 inverted confocal Zeiss www.zeiss.com
double stick tape Scotch/3M 3M ID 70005108587 Double-sided tape, available at most office supply handlers
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 x 0.02 mm tip
EtOH (100%, RNase free) Sigma-Aldrich 32205-M
fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera Leica www.leica-microsystems.com
fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0 Leica www.leica-microsystems.com
fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC Leica www.leica-microsystems.com
Fly: Bru1[M2] Fly stock; This paper
Fly: Bru1[M3] Fly stock; This paper
Fly: Mef2-GAL4 Bloomington Stock Center BDSC:27390 Fly stock
Fly: salm[1] Bloomington Stock Center 3274 Fly stock
Fly: salm[FRT] Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018
Fly: UAS-Bru1IR Vienna Drosophila Research Center GD41568 Fly stock, RNAi hairpin
Fly: UAS-GFP::Gma Bloomington Stock Center BDSC:31776 Fly stock
Fly: UAS-mCD8a::GFP Bloomington Stock Center BDSC:5130 Fly stock
Fly: w[1118] Bloomington Stock Center 3605 Fly stock
Fly: weeP26 Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003
GFP detection reagent, GFP-Booster ChromoTek gba488-100
glycogen Invitrogen 10814-010
image processing software, Photoshop CS6 Adobe www.adobe.com
isopropanol Sigma-Aldrich I9516-25ML 2-propanol
Method 1 (RNA isolation): TRIzol Life Technologies 15596018 Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution
Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit Invitrogen AM1907 TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA
Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit Zymo Research R2070S RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer.
Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134 We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues.
Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System Promega Z6110 We applied the protocol for ‘Purification of RNA from Fibrous Tissues’.
Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit New England Biolabs T2010G We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 μL of RNA Protection Reagent.
Microcentrifuge tubes Thermo Fisher AM12400 RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL
Microscope slides Thermo Fisher 12342108 Standard slides, uncharged, 1 mm
microtome blades PFM Medical 207500003 C35 feather 80mm
Monarch DNase I New England Biolabs T2004-21
Monarch DNase I Reaction Buffer New England Biolabs T2005-21
normal goat serum Thermo Fisher 16210072
OneTaq Polymerase New England Biolabs M0480X
Paintbrush Marabu 1910000000 Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
PBS buffer (1x) Sigma-Aldrich P4417 Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4
PFA PureTip Pipette Tips Elemental Scientific ES-7000-0101 Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice
Phusion High Fidelity Polymerase Thermo Fisher F-530XL
Pipette tips Sigma-Aldrich P5161 Universal 200 mL pipette tips
Preomics iST 8x Kit Preomics P.O.00001 peptide preparation kit for mass spectrometry
Q Exactive mass spectrometer Thermo Fisher 725500 mass spectrometry was performed at the Protein Analysis Unit of the LMU Biomedical Center
Qubit RNA Assay Kit Life Technologies Q32855
rhodamine-phalloidin Invitrogen, Molecular Probes 10063052
RNA concentration Approach 1 & RNA integrity traces, Bioanalyzer Agilent Technologies G2939BA
RNA concentration Approach 2, Nanodrop Thermo Fisher ND-2000
RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer Invitrogen Q33238
RNA Pico Chips Agilent Technologies 5067-1513
RNase A Promega A7937
RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich D5758 DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase.
RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit Invitrogen 18080-044 reverse transcription kit
RT Kit #2: LunaScript New England Biolabs E3010S reverse transcription kit
RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit Qiagen 205410 reverse transcription kit
slide mounting buffer, Vectashield Vector Laboratories H-1200 containing DAPI
statistical software: GraphPad Prism GraphPad Prism www.graphpad.com
statistical software: Microscoft Excel Microsoft Purchased as part of the bundle: Office Home & Student 2019
Table-top centrifuge Eppendorf 5405000760 Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent
tissue/ Kimwipes Sigma-Aldrich Z188956 Standard tissue wipes
Transfer pipette Sigma-Aldrich Z350796 Plastic pipette
Triton-X100 Sigma-Aldrich T9284-500ML
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-00 3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm
Whatman paper Sigma-Aldrich 1004-070 Filter paper circles, Grade 4, 70 mm
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rexiati, M., Sun, M., Guo, W. Muscle-Specific Mis-Splicing and Heart Disease Exemplified by RBM20. Genes. 9 (1), 18 (2018).
  2. Guo, W., et al. RBM20, a gene for hereditary cardiomyopathy, regulates titin splicing. Nature Medicine. 18 (5), 766-773 (2012).
  3. Guo, W., et al. Splicing Factor RBM20 Regulates Transcriptional Network of Titin Associated and Calcium Handling Genes in The Heart. International Journal of Biological Sciences. 14 (4), 369-380 (2018).
  4. Nikonova, E., Kao, S. -. Y., Ravichandran, K., Wittner, A., Spletter, M. L. Conserved functions of RNA-binding proteins in muscle. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 110, 29-49 (2019).
  5. Wang, E. T., et al. Dysregulation of mRNA Localization and Translation in Genetic Disease. The Journal of Neuroscience. 36 (45), 11418-11426 (2016).
  6. Wang, E. T., et al. Antagonistic regulation of mRNA expression and splicing by CELF and MBNL proteins. Genome Research. 25 (6), 858-871 (2015).
  7. Kalsotra, A., et al. A postnatal switch of CELF and MBNL proteins reprograms alternative splicing in the developing heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20333-20338 (2008).
  8. Ho, T. H., et al. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. The EMBO Journal. 23 (15), 3103-3112 (2004).
  9. Lemke, S. B., Schnorrer, F. Mechanical forces during muscle development. Mechanisms of Development. 144, 92-101 (2017).
  10. Iwamoto, H. Structure, function and evolution of insect flight muscle. Biophysics. 7, 21-28 (2011).
  11. Schnorrer, F., Dickson, B. J. Muscle building; mechanisms of myotube guidance and attachment site selection. Developmental Cell. 7 (1), 9-20 (2004).
  12. Spletter, M. L., Schnorrer, F. Transcriptional regulation and alternative splicing cooperate in muscle fiber-type specification in flies and mammals. Experimental Cell Research. 321 (1), 90-98 (2014).
  13. Benoist, P., Mas, J. A., Marco, R., Cervera, M. Differential muscle-type expression of the Drosophila troponin T gene. A 3-base pair microexon is involved in visceral and adult hypodermic muscle specification. Journal of Biological Chemistry. 273 (13), 7538-7546 (1998).
  14. Schönbauer, C., et al. Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects. Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).
  15. Bryantsev, A. L., et al. Extradenticle and Homothorax Control Adult Muscle Fiber Identity in Drosophila. Developmental Cell. 23 (3), 664-673 (2012).
  16. Spletter, M. L., et al. The RNA-binding protein Arrest (Bruno) regulates alternative splicing to enable myofibril maturation in Drosophila flight muscle. EMBO Reports. 16 (2), 178-191 (2015).
  17. Oas, S. T., Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. Arrest is a regulator of fiber-specific alternative splicing in the indirect flight muscles of Drosophila. The Journal of Cell Biology. 206 (7), 895-908 (2014).
  18. Kim, J. H., Jin, P., Duan, R., Chen, E. H. ScienceDirect Mechanisms of myoblast fusion during muscle development. Current Opinion in Genetics & Development. 32, 162-170 (2015).
  19. Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
  20. Rai, M., Nongthomba, U., Grounds, M. D. Skeletal Muscle Degeneration and Regeneration in Mice and Flies. Mechanisms of Regeneration. 108, 247-281 (2014).
  21. Swank, D. M., Wells, L., Kronert, W. A., Morrill, G. E., Bernstein, S. I. Determining structure/function relationships for sarcomeric myosin heavy chain by genetic and transgenic manipulation of Drosophila. Microscopy Research and Technique. 50 (6), 430-442 (2000).
  22. de Joussineau, C., Bataillé, L., Jagla, T., Jagla, K. Diversification of muscle types in Drosophila: upstream and downstream of identity genes. Current Topics in Developmental Biology. 98, 277-301 (2012).
  23. Maqbool, T., Jagla, K. Genetic control of muscle development: learning from Drosophila. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 28 (7-8), 397-407 (2008).
  24. Jagla, K., Kalman, B., Boudou, T., Hénon, S., Batonnet-Pichon, S. Beyond mice: Emerging and transdisciplinary models for the study of early-onset myopathies. Seminars in Cell & Developmental Biology. 64, 171-180 (2017).
  25. Haigh, S. E., et al. Drosophila indirect flight muscle specific Act88F actin mutants as a model system for studying congenital myopathies of the human ACTA1 skeletal muscle actin gene. Neuromuscular Disorders. 20 (6), 363-374 (2010).
  26. Batonnet-Pichon, S., et al. Myofibrillar Myopathies: New Perspectives from Animal Models to Potential Therapeutic Approaches. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (1), 1-15 (2017).
  27. Kreipke, R. E., Kwon, Y. V., Shcherbata, H. R., Ruohola-Baker, H. Drosophila melanogaster as a Model of Muscle Degeneration Disorders. Current Topics in Developmental Biology. 121, 83-109 (2017).
  28. Souidi, A., Zmojdzian, M., Jagla, K. Dissecting Pathogenetic Mechanisms and Therapeutic Strategies in Drosophila Models of Myotonic Dystrophy Type 1. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 4104 (2018).
  29. Sparrow, J., Hughes, S. M., Segalat, L. Other Model Organisms for Sarcomeric Muscle Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 642, 192-206 (2008).
  30. Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 1184, 1-20 (2010).
  31. Swank, D. M. Mechanical analysis of Drosophila indirect flight and jump muscles. Methods. 56 (1), 69-77 (2012).
  32. Spletter, M. L., et al. A transcriptomics resource reveals a transcriptional transition during ordered sarcomere morphogenesis in flight muscle. eLife. 7, 1361 (2018).
  33. Weitkunat, M., Kaya-Çopur, A., Grill, S. W., Schnorrer, F. Tension and force-resistant attachment are essential for myofibrillogenesis in Drosophila flight muscle. Current Biology. 24 (7), 705-716 (2014).
  34. Gunage, R. D., Dhanyasi, N., Reichert, H., VijayRaghavan, K. Drosophila adult muscle development and regeneration. Seminars in Cell & Developmental Biology. 72, 56-66 (2017).
  35. Weitkunat, M., Brasse, M., Bausch, A. R., Schnorrer, F. Mechanical tension and spontaneous muscle twitching precede the formation of cross-striated muscle in vivo. Development. 144 (7), 1261-1272 (2017).
  36. Zappia, M. P., Rogers, A., Islam, A. B. M. M. K., Frolov, M. V. Rbf Activates the Myogenic Transcriptional Program to Promote Skeletal Muscle Differentiation. Cell Reports. 26 (3), 702-719 (2019).
  37. Zappia, M. P., Frolov, M. V. E2F function in muscle growth is necessary and sufficient for viability in Drosophila. Nature Communications. 7 (1), 10509 (2016).
  38. Bryantsev, A. L., et al. Myogenesis in Drosophila melanogaster: Dissection of Distinct Muscle Types for Molecular Analysis. Methods in Molecular Biology. 1889 (5), 267-281 (2019).
  39. Xiao, Y. S., Schöck, F., González-Morales, N. Rapid IFM Dissection for Visualizing Fluorescently Tagged Sarcomeric Proteins. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
  40. Kaya-Çopur, A., Schnorrer, F. RNA Interference Screening for Genes Regulating Drosophila Muscle Morphogenesis. Myogenesis. 1889, 331-348 (2019).
  41. Chechenova, M. B., et al. Functional redundancy and non-redundancy between two Troponin C isoforms in Drosophila adult muscles. Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 760-770 (2017).
  42. Alberts, B. . Molecular Biology of the Cell. , (2017).
  43. Clyne, P. J., Brotman, J. S., Sweeney, S. T., Davis, G. Green fluorescent protein tagging Drosophila proteins at their native genomic loci with small P elements. Genetics. 165 (3), 1433-1441 (2003).
  44. Orfanos, Z., Sparrow, J. C. Myosin isoform switching during assembly of the Drosophila flight muscle thick filament lattice. Journal of Cell Science. 126 (1), 139-148 (2013).
  45. Volohonsky, G., Edenfeld, G., Klambt, C., Volk, T. Muscle-dependent maturation of tendon cells is induced by post-transcriptional regulation of stripeA. Development. 134 (2), 347-356 (2007).
  46. Estes, P. S., Ho, G. L., Narayanan, R., Ramaswami, M. Synaptic localization and restricted diffusion of a Drosophila neuronal synaptobrevin–green fluorescent protein chimera in vivo. Journal of Neurogenetics. 13 (4), 233-255 (2000).
  47. Hida, N., et al. EC-tagging allows cell type-specific RNA analysis. Nucleic Acids Research. 45 (15), 138 (2017).
  48. Thomas, A., et al. A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila. PLoS ONE. 7 (7), 40276 (2012).
  49. Yang, Z. Isolation of mRNA from specific tissues of Drosophila by mRNA tagging. Nucleic Acids Research. 33 (17), 148 (2005).
  50. Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 14110-14115 (2007).
  51. Blazie, S. M., et al. Comparative RNA-Seq analysis reveals pervasive tissue-specific alternative polyadenylation in Caenorhabditis elegans intestine and muscles. BMC Biology. 13 (1), 1775-1821 (2015).
  52. Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. Cell type-specific genomics of Drosophila neurons. Nucleic Acids Research. 40 (19), 9691-9704 (2012).
  53. Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nature Protocols. 6 (1), 56-68 (2011).
  54. Grinstein, M., Dingwall, H. L., Shah, R. R., Capellini, T. D., Galloway, J. L. A robust method for RNA extraction and purification from a single adult mouse tendon. PeerJ. 6 (8), 4664 (2018).
  55. Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning. , (2012).
  56. Brown, R. A. M., et al. Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal. BMC Biotechnology. 18 (1), 16 (2018).
  57. Ford, K. L., et al. Optimisation of laboratory methods for whole transcriptomic RNA analyses in human left ventricular biopsies and blood samples of clinical relevance. PLoS ONE. 14 (3), 02136855 (2019).
  58. Ramachandran, P., Budnik, V. Dissection of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harbor Protocols. (8), 5469 (2010).
  59. Ranganayakulu, G., Schulz, R. A., Olson, E. N. Wingless signaling induces nautilus expression in the ventral mesoderm of the Drosophila embryo. Developmental Biology. 176 (1), 143-148 (1996).
  60. Dutta, D., Bloor, J. W., Ruiz-Gómez, M., VijayRaghavan, K., Kiehart, D. P. Real-time imaging of morphogenetic movements in Drosophila using Gal4-UAS-driven expression of GFP fused to the actin-binding domain of moesin. Genesis. 34 (1-2), 146-151 (2002).
  61. Lemke, S. B., Schnorrer, F. In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae. Journal of Visualized Experiments. (132), e57312 (2018).

Tags

Drosophila MelanogasterFlight MusclesDissectionOmics ApproachesGFP-labeledIndirect Flight MusclePupae DevelopmentGene ExpressionProtein ExpressionRT-PCRWestern BlotStagingSexingFluorescent MicroscopyForcepsPBS

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kao, S., Nikonova, E., Ravichandran, K., Spletter, M. L. Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches. J. Vis. Exp. (152), e60309, doi:10.3791/60309 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image