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Bioengineering

Imagem 3D de amostras de tecido sofx usando um método de coloração específica de raios-X e tomografia computadorizada nanoscópica

Published: October 24, 2019
doi:
10.3791/60251
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1Department of Physics and Munich School of BioEngineering,Technical University of Munich, 2Department of Diagnostic and Interventional Radiology, School of Medicine and Klinikum rechts der Isar,Technical University of Munich

Summary

Um protocolo para visualização 3D de estruturas microscópicas do tecido usando um método específico da coloração do raio X projetado para a tomografia computada do raio X é apresentado.

Abstract

Demonstramos um método baseado em laboratório que combina microCTo de raios-X e nanôdia com uma mancha específica de raios-X, que tem como alvo o citoplasma celular. O protocolo descrito é fácil de aplicar, rápido e adequado para amostras maiores de tecidos moles. A metodologia apresentada permite a caracterização de estruturas de tecidos cruciais em três dimensões e é demonstrada em um rim de rato inteiro. A abordagem multiescala permite a imagem de todo o rim do rato e suporta a seleção de novos volumes de interesse, que são adquiridos com resoluções mais elevadas que vão para a faixa de nanômetros. Assim, a morfologia de tecidos moles com um nível de detalhe semelhante ao que as imagens de microscopia histológica correspondente é reproduzida. Umas introspecções mais profundas na configuração 3D de estruturas do tecido são conseguidas sem impedir umas investigações mais adicionais através dos métodos histological.

Introduction

Caracterização completa de espécimes de tecidos moles requer informações sobre a microestrutura do tecido 3D. O padrão ouro atual para análises de amostras de tecidos moles é a histopatologia. O tecido e a morfologia celular do espécime são explorados em 2D dentro de regiões selecionadas de interesse (ROIs) usando microscopia óptica1. Este método, no entanto, tem várias desvantagens. A preparação da amostra é demorada, complicada, destrutiva e propensa a artefatos. Os slides microscópicos produzidos fornecem apenas informações 2D paralelas ao plano de secção. Muitas vezes, o número de seções histológicas, que são investigadas, é restrito devido a restrições de tempo2,3.

Nos últimos anos, o campo da histologia 3D evoluiu. Aqui, fatias de tecido virtual de qualquer plano espacial desejado são acessíveis. Isso permite o rastreamento de estruturas em toda a amostra, o que leva a uma compreensão mais profunda da arquitetura do tecido 3D e das mudanças estruturais associadas a diferentes patologias. Vários métodos foram desenvolvidos para alcançar a geração de dados de volume 3D. Eles variam de abordagens baseadas em seção de série, que usam microscopia de luz ou eletrônica4,5,6,7,8,a métodos de imagem de face de bloco, como imagens 3D episcopic ou microscopia eletrônica de varredura de face em bloco7,8,9. Todos os métodos mencionados, no entanto, envolvem seção ou destruição completa da amostra, o que não permite novas investigações. A resolução obtida é altamente dependente do processo de secção ser propenso a artefatos como descrito na histologia convencional. Estes métodos sofrem também de artefatos de alinhamento.

Técnicas de imagem de raios-X 3D, como tomografia computadorizada microscópica e nanoscópica (microCT e nanoCT) aspiram a gerar dados de alta resolução 3D sem destruição da amostra de tecido. Até agora, o fraco contraste de atenuação de raios-X dos tecidos moles e o acesso limitado a altas resoluções em um ambiente de laboratório prejudicaram seu uso para visualização 3D de estruturas microscópicas de tecido. Os recentes avanços em direção à TomOGrafia de raios-X de alta resolução de laboratório permitem resoluções bem abaixo de 1 μm10,11,12,13.

A falta de contraste no tecido mole na imagem de raios-X à base de atenuação convencional é compensada por agentes de coloração, que aumentam o contraste de atenuação de raios-X. Agentes de coloração conhecidos de outras técnicas de imagem, como tetróxido de osmium (OsO4),iodo iodeto de potássio (IKI) ou ácido fosoftungstic (PTA) são frequentemente usados14,15,16,17, 18,19,20,21,22,23,24,25. Agentes de coloração que permitem (i) segmentação biológica específica, (ii) coloração homogênea e completa, (iii) fácil manuseio, (iv) penetração rápida do tecido sem criar artefatos como anéis de difusão, (v) manchas de tecido grandes e densas e (vi) compatibilidade total com histopatologia são necessárias para estabelecer tcs de raios-X como ferramenta para visualização 3D de estruturas de tecidomicroscópicas. Neste trabalho, mostramos como as amostras de tecido sofroso são preparadas para imagens de Raios-X com uma mancha de raios-X específica de citoplasma com base na eosina que atende aos requisitos declarados acima de26.

A abordagem de imagem multiescala garante a avaliação da qualidade da coloração através de uma medição de microCT de visão geral e a seleção de volumes de interesse (IV) para novas investigações de alta resolução. A qualidade da coloração é analisada com foco em parâmetros de coloração, como (i) completude, (ii) aparência de anéis de difusão, (iii) aprimoramento de contraste, (iv) aparência de artefatos tc, como estrias e (v) homogeneidade. A configuração de nanoCôCTa baseada em laboratório, que usa ampliação geométrica para alcançar resoluções até 100 nm, visualiza a morfologia de tecidos moles em (nível sub)-celular10,27. Uma análise comparativa das fatias de nanoTO Com imagens correspondentes de microscopia histológica confirma a reprodução da arquitetura do tecido com detalhes semelhantes em um nível microscópico em 2D, permitindo caracterização histopatológica do tecido Amostra. Este protocolo de vídeo detalhado destina-se a aumentar a conscientização e destacar o potencial desta metodologia como ferramenta de imagem de tecidos moles 3D não destrutiva sendo de interesse para uma ampla comunidade científica, como zoólogos, biólogos e saúde Profissionais.

Protocol

Cuidado: Consulte todas as folhas de dados relevantes de segurança material (MSDS) antes da utilização. Vários dos produtos químicos utilizados no protocolo são agudamente tóxicos e cancerígenos. Por favor, use todas as práticas de segurança adequadas ao executar o protocolo de coloração, incluindo o uso de controles de engenharia (capô de fumaça, porta-luvas) e equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, luvas, jaleco, calças de corpo inteiro, sapatos fechados). Animais utilizados:Habitação animal foi realizada no Klinikum rechts der Isar, Universidade Técnica de Munique, de acordo com as diretrizes da União Europeia 2010/63. A remoção de órgãos foi aprovada a partir de um comitê interno de proteção animal de Klinikum rechts der Isar, Munique, Alemanha (referência interna número 4-005-09). Todos os procedimentos estavam de acordo com as diretrizes e regulamentos relevantes. Todos os laboratórios são inspeccionados para acordo com os princípios da OCDE de boas práticas laboratoriais. 1. Protocolo de coloração eosin Para fixar amostras de tecido sofrível, preencha um tubo de centrífuga de 50 mL com uma solução fixa contendo 9,5 mL de 4% (v/v) solução de formaldeído (FA) e 0,5 mL de ácido acético glacial (AA).NOTA: Prepare a solução FA recentemente a partir de uma solução fa livre de ácido de 37% estabilizada com aproximadamente 10% metanol. Diluir a solução FA ainda mais com o soro soro lógico tampão de fosfato dulbecco (DPBS). Escolha DPBS sem cálcio e magnésio. Mantenha a solução fa diluída não superior a um mês. Durante a acidificação, o pH da solução fixa está mudando de neutro para aproximadamente 3.CUIDADO: Porque FA é órgão agudo tóxico, corrosivo e cancerígeno, o uso de uma capa de fumaça é obrigatório e equipamentos pessoais de proteção adequados devem ser usados. Adicione a amostra de tecido mole recém-removida a um tubo de centrífuga de 50 mL e leve à geladeira o tubo de centrífuga de 50 mL para 24-72h.NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Lave a amostra de tecido sofrinho com solução DPBS por 1h. Para manchar a amostra fixada de tecido sofroso (por exemplo, um rim de rato inteiro), coloque o tecido mole em 2 mL de solução de coloração Eosin Y e incubada a amostra por 24 h. Mantenha a amostra em uma placa de agitação horizontal para um balanço suave (cerca de 60 rpm) durante a incubação Processo.NOTA: A solução de eosina Y-coloração tem uma concentração de 30% (w/v) em água destilada. Escolha o volume da solução de coloração de tal forma que a amostra seja completamente coberta pela solução de coloração e permita que a amostra se mova livremente dentro do recipiente da amostra. O tempo de incubação pode diferir para outras amostras e tem que ser ajustado em conformidade. Após a coloração, retire cuidadosamente a amostra de tecido sofrinho do recipiente da amostra. Retire cuidadosamente o excesso de agente de coloração com papel de tecido de celulose. Coloque a amostra de tecido sofroso em um recipiente de amostra cônica acima de uma fase de vapor de etanol para armazenamento e uso adicional.NOTA: O recipiente de amostra cônica deve sempre conter algumas gotas de 70% (v/v) etanol na parte inferior do tubo para manter a amostra de tecido sofroso úmida e evitar artefatos. 2. Imagens de microCT de raios-X NOTA: As medições de microCT de raios-X foram realizadas com um scanner de microCT, que oferece medições de TC de visão geral (a capacidade de visualizar toda a amostra dentro do campo de visão (FOV)) e o desempenho de medições de TC de alta resolução (a capacidade de se concentrar em em um volume de interesse desejado (VOI) da mesma amostra) até 1 μm. Monte a amostra de tecido sofroso a um suporte de amostra apropriado. Certifique-se de um ajuste apertado da amostra no suporte da amostra para evitar que a amostra se mova durante as medições de Tom PC de raios-X. Em caso do rim manchado do rato: Prepare um suporte da amostra com os dois tubos da centrífuga, por cento apartir de um tubo é cortado. Cola os dois tubos de centrífuga juntos usando adesivo de dois componentes. Assegure um alinhamento reto dos tubos de centrífuga em torno do eixo de rotação. Espere que o adesivo endureça. Uma vez que o suporte da amostra está pronto para uso, transfira o rim do rato para o tubo de centrífuga intacto, que contém algumas gotas de 70% (v/v) etanol na parte inferior do tubo.NOTA: A estabilidade da amostra é crucial. Tire um tempo para preparar a amostra para medições de TC de raios-X. A amostra de tecido sofroso é mantida em fase de vapor de etanol para manter a amostra úmida durante as medições de Tom OBstídrico de raios-X e evitar que a amostra de tecidos moles encolhimento e outros artefatos. A amostra de tecido sofroso não deve estar em contato com o solvente para evitar o acúmulo do solvente em torno da amostra durante a medição de TC de raios-X, o que pode levar ao movimento da amostra durante a medição ou pode causar problemas durante a reconstrução. Se o portador da amostra não permitir a retenção de solvente na parte inferior, um papel de celulose umedecido com 70% (v/v) etanol pode ser colocado no suporte da amostra. Note-se que artefatos de encolhimento devido ao etanol solvente não foram observados.NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Após o alinhamento cuidadoso da amostra, escolha parâmetros de aquisição para melhor qualidade de imagem. No caso dos dados de microCT apresentados, adquirir a varredura em uma tensão máxima de 50 kV, uma corrente de 3,5 W usando projeções 1601 igualmente distribuídas acima de 360°.NOTA: Os parâmetros de aquisição para a tomografia computadorizada de visão geral foram escolhidos para melhor qualidade de imagem. Como tal, o objetivo da câmera 0,39x foi escolhido para cobrir toda a amostra dentro do campo de visão (FOV). Isso resultou em um tamanho de pixel eficaz de 12 μm. O tempo de exposição de 2 s por projeção forneceu um bom sinal em relação ao ruído. O ROI para a tomografia computadorizada de alta resolução foi identificado usando os dados de microCT da varredura de visão geral. Os scanners microCT geralmente incorporam uma ferramenta de software integrada, que permite a seleção precisa do ROI determinado. Para os dados de TC de alta resolução, o objetivo da câmera 4x foi escolhido resultando em um tamanho de pixel eficaz de 3,3 μm. Aqui, um tempo de exposição de 15 s por projeção era necessário.NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Após a aquisição dos dados de TC de raios-X, processe as projeções em conformidade para a reconstrução do volume 3D. No caso dos dados de microCT apresentados: Reconstrua os dados de TC de raios-X com o software integrado.NOTA: As renderizações de volume dos dados de microCT mostrados na Figura 1 e Na Figura 2 foram geradas usando um software de visualização.NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. 3. Imagens de nanoC de raios-X NOTA: O scanner de nanoCto de raios-X foi desenvolvido internamente. O instrumento livre de lentes é equipado com uma fonte de raios-X de nanofoco e um detector de contagem de fótons únicos. Os dados 3D com resoluções até 100 nm podem ser gerados10. Geralmente, os sistemas de nanoCT, incluindo aqueles com óptica de raios-X estão disponíveis comercialmente e não estão limitados ao scanner de nanoCto descrito. Preparação da amostra de NanoCT Prepare VOIs da amostra de tecido sofros. Corte o tecido mole em pedaços muito pequenos de aproximadamente 0,5 mm de comprimento de borda usando um bisturi e um estereoscópio. Em caso de rim do rato: Corte o rim do rato em duas metades ao longo do eixo mais longo. Pegue metade do rim do rato e prepare diferentes regiões anatômicas, como córtex renal e medula renal.NOTA: A outra metade do rim do rato foi transferida para a histopatologia, onde a amostra foi incorporada na parafina e processada em conformidade para produzir as seções histológicas típicas, como visto na Figura 3c e Figura 3d . Transfira os pequenos pedaços antes do primeiro passo de desidratação para uma nova placa de Petri, onde permanecem para todas as etapas subsequentes. Desidratar as amostras usando concentrações (todas v/v) em %: 50, 60, 70, 80, 90, 96 e 100 etanol equilibrado com água destilada. Executar cada passo de desidratação para 1 h cada.NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Mantenha os pequenos pedaços de tecido em 100% de etanol durante a noite. Ponto crítico seco (CPD) as partes pequenas do tecido.NOTA: A aplicação do CPD permite a desidratação completa da amostra de tecido trocando o solvente (aqui etanol) com o agente de secagem (aqui CO2). Isso foi necessário para garantir que a amostra possa ser montada nos detentores da amostra do nanóTO, não se mova durante a medida e possa ser posicionada muito próxima da fonte de raios-X para permitir a melhor ampliação geométrica. A configuração de nanoCTO é baseada na mera ampliação geométrica, com o fator de ampliação sendo definido como a distância de origem ao detector sobre a distância de origem a amostra. A técnica de secagem foi introduzida pela primeira vez por Anderson para preservar a estrutura 3D de espécimes biológicos para microscopia eletrônica28. Uma visão geral da técnica é fornecida por Bray29. Pré-preencha a câmara de vácuo com 100% de etanol. Transfira os pedaços de tecido pequeno em uma cápsula micro-porosa e colocá-lo na câmara de vácuo do CPD. Fechar o sistema.NOTA: Uma vez que a alta pressão está envolvida no processo de CPD, certifique-se de que todas as partes do CPD, em particular os acessórios, estejam intactas e o sistema esteja devidamente fechado. Arrefecer a câmara a 6- 8°C e encha-se com COlíquido 2. Ao mexer, espere 3 min para permitir a mistura adequada dos dois componentes. Escorra cuidadosamente a câmara. Certifique-se de que o portador da amostra ainda esteja coberto com solvente. Repita esta etapa dez vezes para permitir a substituição completa do etanol com CO2 dentro da amostra. Após o enchimento final da câmara com CO2,aqueça a máquina ao ponto crítico de CO2 (31 °C e 73,8bar), seguido por uma liberação muito lenta do CO gasoso2 ao longo de um tempo de 30 min.NOTA: A liberação do gás deve ser realizada muito lentamente, caso contrário, a água condensada pode se formar na amostra. Certifique-se de que a temperatura não caia abaixo do ponto crítico do CO2. Abra apenas a máquina cpd quando toda a pressão foi liberada do sistema. Retire os pedaços de tecido CPD rapidamente da máquina e mantê-los em uma nova placa de Petri armazenados em um desidratador antes de uso.NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Monte as partes do tecido do CPD a um suporte apropriado da amostra. Certifique-se de um ajuste apertado da amostra no suporte da amostra para evitar que a amostra se mova durante as medições de TC. No caso das partes do tecido renal do rato CPD: Glue as partes do tecido com supercola a um suporte de amostra.NOTA: Qualquer movimento indesejado da amostra durante as medições de TC pode causar problemas durante a reconstrução do volume – especialmente ao adquirir um conjunto de dados com o tamanho do voxel nanômetro.NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Após o alinhamento cuidadoso da amostra, escolha parâmetros de aquisição para melhor qualidade de imagem. No caso dos dados de nanoCTO apresentados: Adquirir projeções em uma tensão máxima de 60 kV com projeções de 1599 igualmente distribuídas acima de 360° e um tamanho de voxel de aproximadamente 400 nm.NOTA: Uma única medida de TC adquirida a 400 nm tamanho do voxel tem um FOV de 75 μm na direção do eixo de rotação (vertical) e aproximadamente 560 μm na direção perpendicular ao eixo de rotação (horizontal). Para investigar volumes maiores, uma extensão do FOV ao longo do eixo de rotação pode ser alcançada combinando vários exames em diferentes posições verticais. Além disso, exames de tomografia local podem ser realizados para medir amostras com um diâmetro perpendicular de diâmetro de amostra maior ao eixo de rotação do que dado pelo FOV de uma tomografia computadorizada global. Os dados de nanoCTO foram adquiridos com um tempo de exposição de 4 s por projeção. Como tal, o tempo total de aquisição por conjunto de dados foi de aproximadamente 3,5 h.NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Após a aquisição dos dados de TC, processe as projeções em conformidade para a reconstrução do volume 3D. No caso dos dados de nanoCto apresentados, normalize as projeções adquiridas com imagens flatfield. Melhorar a nitidez das projeções usando um algoritmo de desconvolução Richardson-Lucy30,31. Use uma função gaussiana rotacionals simétrica com um desvio padrão de um pixel como kernel de deconvolução. Aplique o algoritmo de recuperação de fases de Paganin às imagens afiadas para aumentar o contraste de tecidos moles. Defina os parâmetros do algoritmo para otimizar a qualidade da imagem32. Reconstrua as projeções pré-processadas com um algoritmo de backprojection filtrado de última geração.NOTA: A Figura 3 avalia os dados de nanoCs obtidos com seções histológicas correspondentes, que tinham aproximadamente 7 μm de espessura. Portanto, fatias de projeção de intensidade mínima de 18 fatias de nanoCadjacentes com espessura virtual de aproximadamente 7 μm foram geradas por meio do cálculo do valor mínimo para cada pixel nas fatias relevantes. Um software de visualização foi usado para tornar o volume dos dados de nanoC, que é exibido na Figura 4.

Representative Results

A Figura 1 mostra fatias de TC e processamento de volume de dados microCT de baixa resolução destacando o aprimoramento do contraste após a coloração. A figura 2 mostra fatias de TC e processamento de volume de dados microCT de alta resolução derivados de uma tomografia local de todo o rim do rato. A figura 3 mostra fatias de TC de dados de nanoCem em comparação com as seções histológicas correspondentes. A figura 4 mostra a fatia de TC e a renderização do volume de dados do nanoCT que destacam detalhes estruturais a nível celular. A medição de microCT de baixa resolução permite uma visão geral de todo o órgão e ajuda a identificar volumes de interesse (IC) para a medição de microCT de alta resolução. Através desta abordagem multiescala, o VOI para o nanóCTo é determinado. A nanocção permite uma visão muito detalhada da amostra de tecidos moles no nível celular. O estudo comparativo com a seção histológica correspondente destaca a compatibilidade completa com a histopatologia. Aqui, a abordagem de imagem multimodal está confirmando os resultados obtidos com ambas as modalidades. Figura 1. As fatias de TC e a renderização de volume dos dados de microCT de baixa resolução. (a,b)Imagens de visão geral do mesmo rim do rato antes e depois da coloração, respectivamente, destacando o aprimoramento de contraste obtido após a aplicação do protocolo de coloração baseado em eosina. Ambos os conjuntos de dados de microCT foram adquiridos usando parâmetros de aquisição idênticos. O tamanho do voxel em ambos os conjuntos de dados é de 12 μm. O aprimoramento do contraste alcançado em (b) permite a identificação das seguintes regiões estruturais anatômicas: Córtex (I), medula exterior (II) com distinção adicional em listras externas de medula exterior (IIa) e listras internas de medula exterior (IIb), medula interior (III), papila (IV) e pélvis renal (V). (c)Processamento de volume de dados de microCT mostrando uma seção sonittal virtual através de todo o rim do rato. Este número foi modificado a partir de Busse e Müller et al.26Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2. Fatia de TC e processamento de volume de dados microCT de alta resolução derivados do mesmo rim do rato após a aplicação do protocolo de coloração baseado em eosina desenvolvido. (a)O canto esquerdo mostra a imagem de microCT visão geral destacando o ROI (caixa azul) para a imagem exibida de alta resolução. As seguintes regiões estruturais anatômicas são identificáveis: Córtex (I), medula exterior (II) com mais distinção em listras externas de medula exterior (IIa) e listras internas de medula exterior (IIb), medula interior (III), calipso menor (IV) e vasos (V e VI). (b) Volume de renderização de juros dos dados microCT de alta resolução adquiridos com um tamanho voxel de 3,3 μm. A região de medula e uma seção virtual através de uma embarcação derivada de uma tomografia local de todo o rim são mostradas. Este número foi modificado a partir de Busse e Müller et al.26. Clique aqui para ver uma versão maior deste número. Figura 3. Ct fatias de dados de nanoC (a,b) em comparação com as seções histológicas (c,d) derivadas do mesmo rim do rato após a aplicação do protocolo de coloração baseado em eosina desenvolvido. (a)A imagem de nanôdo da mesma amostra de rim do rato após a coloração, dissecação e CPD mostra estruturas detalhadas da região (IIb) vistas na Figura 1 e Na Figura 2. Estes são conhecidos como membros ascendentes grossos do laço de Henle. (b) Fatia de projeção de intensidade mínima derivada do mesmo conjunto de dados de nanoCTO mostrado(a)com uma espessura de fatia virtual de aproximadamente 7 μm, o que permite a visualização clara dos núcleos celulares. (c)Seção histológica representativa exibindo membros ascendentes grossos do laço de Henle com visualização clara de núcleos celulares e borda de escova. A seção histológica tem uma espessura aproximada de 7 μm e foi obtida da mesma amostra de rim do rato após a coloração e a incorporação aplicadas da eosina em um bloco da parafina. (d)Seção histológica representativa com aplicação de hematoxilina de manchas contrárias destacando os núcleos celulares em roxo. Preparação da seção histológica próxima à seção mostrada em(c)com espessura aproximada de 7 μm. Este número foi modificado a partir de Busse e Müller et al.26Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4. Tomografia e processamento de volume de dados de nanoC. (a)A imagem de nanôdo da mesma amostra de rim do rato mostrando as estruturas conhecidas como membros ascendentes grossos do laço de Henle. Esta é uma visão detalhada da região (IIb) vista na Figura 1 e Figura 2 adquirida a partir de um pequeno pedaço do rim com um tamanho voxel de aproximadamente 400 nm. A preparação da amostra envolveu coloração, dissecação e CPD.(b)Processamento de volume de dados nanoCT visualizando a estrutura 3D de membros ascendentes grossos dos laços de Henle. Este número foi modificado a partir de Busse e Müller et al.26Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Atualmente, a eosina é usada como o protocolo histológico padrão para rotular o citoplasma celular. O agente de coloração é aplicado como uma solução aquosa de 0,1% (w/v) para fatias microscópicas de tecido mole (geralmente cortadas com espessura de 2-10 μm)33. A aplicação deste protocolo histológico padronizado a amostras de tecido 3D, como um rim de rato inteiro, não resulta em uma imagem de TC melhorada por contraste de atenuação. Por um lado, isso pode ser atribuído às baixas propriedades intrínsecas de atenuação de tecidos moles para energias de raios-X normalmente usadas de sistemas de microCT baseados em laboratório. Normalmente, o tecido mole é composto principalmente de carbono, hidrogênio, oxigênio e nitrogênio34,e, portanto, não resulta em aumento de contraste. Por outro lado, a baixa concentração de eosina utilizada para coloração foi o fator limitante. Mesmo que uma molécula de eosina tenha quatro átomos de brometo (bromo de elemento sumido de alto número atômico com Z = 3534),os níveis de sensibilidade necessários para imagens de TC de raios-X não foram atendidos.

Para superar esse desafio de baixo contraste de atenuação, várias concentrações de eosina foram investigadas. Uma limitação é aqui a solubilidade máxima da eosina na água, que é de 30% (w/v) em uma solução aquosa. Melhor aprimoramento do contraste de atenuação dentro do tecido mole foi observado com a maior concentração de eosina, o que era esperado de acordo com a Lei Lambert-Beer. Portanto, o protocolo final de coloração foi realizado com a maior concentração.

A pergunta como preparar o tecido macio de forma otimizada em um nível molecular para o procedimento de coloração para melhorar ainda mais o aprimoramento do contraste foi respondida pelo ajuste do pH. Aqui, a acidificação da amostra de tecido sofroso durante a fixação ou antes da coloração foi considerada crucial. Isto também foi mostrado por Hong et al.35. O maior acúmulo de agente de coloração dentro do citoplasma celular pelo ácido foi alcançado através de interações iônicas melhoradas, que foram resultado da protonação de cadeias laterais de aminoácidos de proteínas e peptídeos presentes dentro do citoplasma celular. Um resultado representativo destacando o aumento do contraste em comparação com uma amostra não manchada de tecidos moles é mostrado na Figura 1a,b. Aqui, foi alcançada uma visão estrutural de um rim de camundongo inteiro visualizando regiões anatômicas cruciais, como córtex, medula, papila e pélvis renal.

O protocolo de coloração apresentado é simples de aplicar e contém apenas três etapas. Os reagentes necessários são facilmente acessíveis. O tempo total de coloração de 24 horas é rápido para uma coloração de órgão inteiro, o que permite a visualização 3D de amostras de tecido (Figura 1c, Figura 2b e Figura 4b) em um ambiente de laboratório em múltiplas escalas até o nível celular. Note-se que o tempo de coloração global e volume da solução de coloração necessária pode solicitar algumas adaptações, dependendo da natureza da amostra. No entanto, o protocolo de coloração à base de eosina é adequado para coloração de órgãos inteiros, que, em seguida, permite imagens de microCT de alta resolução de órgãos inteiros. Artefatos de encolhimento devido ao etanol solvente, que foi usado para manter a amostra úmida durante as medições de microCT, não foram observados. Etapas de preparação adicionais são necessárias para a imagem nanoCT, o que permite a investigação de pedaços de tecido menorrecuperados da amostra original. Com relação às futuras aplicações histopatológicas, os exames de visão geral fornecerão insights valiosos sobre regiões e estruturas anatômicas alteradas, que permitem a determinação dos ROIs, como demonstrado na Figura 2a. Estes podem ser estudados em 3D por microCT (Figura 1c e Figura 2b)ou nanct(Figura 4b)e avaliados em 2D com histologia (Figura 3).

Outra força do protocolo é vista na compatibilidade total com a histopatologia em relação ao procedimento de coloração de H&E. A aplicação do procedimento de coloração à base de eosina a amostras em massa não impede novas investigações histológicas (Figura 3),embora a concentração aplicada de eosina seja muito maior em comparação com a solução de coloração histológica. A fatia de nanoCTO com espessura virtual de aproximadamente 400 nm(Figura 3a)compara já muito bem com a seção histológica (Figura 3c),que foi derivada da amostra correspondente de tecido sofroso. Considerando a espessura aproximada de uma seção histológica com 7-10 μm, a geração de fatias de projeção de intensidade mínima dos dados de nanoC (Figura 3b),que correspondem a uma espessura virtual de aproximadamente 7 μm, permite uma melhor comparação com a seção histológica (Figura 3c). Aqui, os núcleos celulares são claramente revelados como área de não atenuação como eosina especificamente manchas de proteínas e peptídeos no citoplasma celular33.

A aplicação de uma coloração contrária mais adicional com métodos histological padrão é possível, mesmo que a ordem da coloração comparada ao procedimento histological padrão da coloração fosse invertida. Começando primeiro com o protocolo de coloração baseado em eosina desenvolvido para TC, seguido de coloração contrária dessas seções histológicas à base de eosina com hematoxilina, permite compatibilidade total e resulta em uma coloração de alta qualidade exibindo a forma esperada de aparência. A coloração específica dos núcleos celulares com a hematoxilina azeda de Mayer foi aplicada à seção histológica destacando os núcleos celulares em roxo (Figura 3d). A aplicação da coloração contrária histológica é limitada atualmente à H-mancha. Outras manchas tetológicas padrão contrárias, como a base do ácido periódico Schiff, Elastica van Gieson ou prata Gomori têm de ser avaliadas, bem como a compatibilidade com técnicas imunohistológicas precisa ser testada.

O protocolo de coloração à base de eosina permite (i) segmentação específica de citoplasma celular, (ii) coloração homogênea e completa, (iii) fácil implementação, (iv) penetração rápida do tecido sem criar artefatos como anéis de difusão, (v) a coloração de grandes e densas amostras de tecido mole e (vi) compatibilidade total com histopatologia em relação à mancha de H&E. Esses requisitos são importantes para permitir a visualização de TCdede de raios X de alta resolução de tecidos moles até o nível celular. Em combinação com os dispositivos nanoCTO recentemente desenvolvidos12,36,37,geração não destrutiva de fatias histológicas virtuais que são comparáveis em contraste e resolução aos dados histológicos convencionais é possível. Essa abordagem combinada permitirá o estabelecimento de TC de raios-X como uma ferramenta valiosa para a visualização 3D de estruturas de tecidomicroscópicas.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos ao Dr. Enken Drecoll por discussões histológicas e à equipe extremamente útil da Excillum AB, suécia. Reconhecemos o apoio financeiro através do Dfg Cluster of Excellence Munich Center for Advanced Photonics (MAP) e do DFG Gottfried Wilhelm Leibniz Program. Além disso, este projecto de investigação recebeu financiamento do programa de investigação e inovação Da União Horizonte 2020 da União Europeia ao abrigo do Acordo de Subvenção Marie Skłodowska-Curie No. H2020-MSCA-IF-2015-703745-CONSALT.

Materials

50-ml centrifuge tube by Falcon VWR 734-0453
Formaldehyde solution, 37% Carl Roth CP10.2 acid-free, stabilized with ~10% MeOH
Glacial acetic acid Alfa Aesar 36289.AP
Eosin Y disodium salt Sigma-Aldrich E4382 certified by Biological Stain Commission
Phosphate Buffered Saline (PBS) Merck L1825 Dulbecco's formualtion, w/o calcium and magnesium
Sample Tubes by Nalgene Carl Roth ATK5.1
Rocking Shaker ST5 CAT 60281-0000
Cellulose tissue paper VWR 115-0600
Forceps, by USBECK Laborgeräte VWR 232-0096
Microcentrifuge tubes by Eppendorf VWR 211-2120 safe-lock, 2.0 ml
Ethanol absolute by Baker Analyzed VWR 80252500
Disposable safety scalpel by Aesculap VWR  AESCBA210
Petri dish by Sterilin VWR 391-2019
Plastic pasteur pipette Carl Roth EA68.1 graduated, 1 ml
Desiccator by Duran VWR SCOT247826954
Silicone grease by Bayer Sigma-Aldrich 85404 high-vacuum
Carbon dioxide cylinder with standpipe Linde 3700113 10 kg, short
micro-porous treatment capsule PLANO GmbH 4614 pore size 78 µm (B)
Bal-Tec CPD 030 Bal-Tec AG CO2 as drying agent
Stemi 2000-C stereomicroscope with KL 1500 LCD Zeiss this stereomicroscope has been updated(1)
Zeiss Xradia Versa 500 Zeiss this microCT scanner has been updated(2)
Avizo Fire 8.1 Thermo Fisher Scientific
PILATUS detector as part of the nanoCT scanner Dectris single-photon counting detector(4,5); there are commercially availble nanoCT systems available (6,7)
nanofocus X-ray source as part of the nanoCT scanner Excillum high-flux nanofocus X-ray transmission tube(3); there are commercially availble nanoCT systems available(6,7)
(1) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS stereomicroscopes https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/Stereomikroskope/1006> (September 06, 2019).
(2) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 510 Versa https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/zeiss-xradia-510-versa.html> (April 10, 2019).
(3) Nachtrab, F. et al. Development of a Timepix based detector for the NanoXCT project. Journal of Instrumentation 10 (11), C11009, (2015).
(4) Kraft, P. et al. Performance of single-photon-counting PILATUS detector modules. Journal of Synchrotron Radiation 16 (3), 368-375, (2009).
(5) Kraft, P. et al. Characterization and calibration of PILATUS detectors. IEEE Transactions on Nuclear Science 56 (3), 758-764, (2009).
(6) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 810 Ultra https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/xradia-810-ultra.html> (April 9 2019).
(7) Company, G. E. GE product information: Phoenix nanotom m, https://www.gemeasurement.com/sites/gemc.dev/files/geit-31344en_nanotom_m_0517.pdf> (April 10, 2019).
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Busse, M., Müller, M., Kimm, M. A., Ferstl, S., Allner, S., Achterhold, K., Herzen, J., Pfeiffer, F. 3D Imaging of Soft-Tissue Samples using an X-ray Specific Staining Method and Nanoscopic Computed Tomography. J. Vis. Exp. (152), e60251, doi:10.3791/60251 (2019).
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