X線特異的染色法とナノスコピックコンピュータ断層撮影法を用いた軟組織試料の3次元イメージング

注意: 使用前に関連するすべての材料安全データシート(MSDS)を参照してください。プロトコルで使用される化学物質のいくつかは、急性毒性および発癌性である。エンジニアリングコントロール(ヒュームフード、グローブボックス)および個人用保護具(安全メガネ、手袋、ラボコート、全長ズボン、クローズドつま先シューズ)の使用を含む染色プロトコルを実行する際には、すべての適切な安全対策をご使用ください。 使用される動物:動物住宅は、欧州連合ガイドライン2010/63に従ってミュンヘン工科大学クリニクム・レヒト・デア・イサールで行われました。臓器除去は、クリニクム・レヒト・デル・イサール、ミュンヘン、ドイツの内部動物保護委員会(内部参照番号4-005-09)から承認された。すべての手順は、関連するガイドラインと規制に従っていました。すべての実験室はよい実験室の練習のOECDの原則に従って点検される。 1. エオシン染色プロトコル 軟部組織試料を固定するには、50mL遠心チューブに、9.5mLの4%(v/v)ホルムアルデヒド溶液(FA)と0.5mLの氷酢酸(AA)を含む固定液を充填します。注:約10%のメタノールで安定化した37%酸フリーFA溶液から新鮮なFA溶液を調製します。ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)でさらにFA溶液を希釈します。カルシウムとマグネシウムを含まないDPBSを選択してください。希釈FA溶液は1ヶ月以下に保ちます。酸性化の間、固定溶液のpHは中性から約3に変化している。注意:FAは急性臓器毒性、腐食性および発癌性であるため、ヒュームフードの使用は必須であり、適切な保護パーソナル機器を使用する必要があります。 取り出したばかりの軟組織サンプルを50mL遠心管に加え、50mL遠心管を24~72h冷蔵します。注: プロトコルはここで一時停止できます。 軟組織試料をDPBS溶液で1時間洗浄します。 固定された軟部組織サンプル(例えば、マウス腎臓全体)を染色するには、軟組織を2mLのエオシンY染色液に入れ、サンプルを24時間インキュベートし、インキュベーション中に滑らかな揺れ(ca. 60 rpm)のために水平揺れ板にサンプルを置く。プロセス。注:エオシンY染色液は、蒸留水中の濃度が30%(w/v)です。サンプルが染色溶液によって完全に覆されるように染色溶液の体積を選択し、サンプル容器内でサンプルが自由に移動できるようにします。インキュベーション時間は他のサンプルによって異なる場合があり、それに応じて調整する必要があります。 染色後、サンプル容器から軟部組織試料を慎重に取り出します。 セルロースティッシュペーパーで過剰な染色剤を慎重に取り除きます。 軟組織試料をエタノール蒸気相の上の円錐形サンプル容器に入れ、さらに使用します。メモ:円錐形のサンプル容器は、軟部組織サンプルを湿らせ、アーティファクトを防ぐために、常にチューブの底部に70%(v/v)エタノールの数滴を含んでいる必要があります。 2. X線マイクロCTイメージング 注:X線マイクロCT測定は、概要CT測定(視野内のサンプル全体を画像化する機能(FOV))と高解像度CT測定の性能(集中力)を提供するマイクロCTスキャナを使用して行いました。非常に同じサンプルの目的の1つの所望の容積(VOI)で1μmまで下がった。 軟組織サンプルを適切なサンプルホルダーに取り付けます。サンプルホルダーのサンプルのしっかりとしたフィット感を確保し、X線CT測定中にサンプルが動かないようにします。 染色されたマウス腎臓の場合:2本の遠心管を持つサンプルホルダーを準備し、それによって1本のチューブの底部を切断します。2成分接着剤を使用して、2つの遠心チューブを接着します。回転軸を中心に遠心管の直線位置合わせを確認します。接着剤が固まるのを待ちます。 サンプルホルダーを使用する準備ができたら、マウス腎臓を無傷の遠心管に移し、チューブの底部に70%(v/v)エタノールを数滴保持します。注: サンプルの安定性は非常に重要です。X線CT測定用のサンプルの準備に時間をかけてください。軟部組織サンプルは、X線CT測定中にサンプルを湿っと保ち、軟組織サンプルが収縮やその他のアーティファクトを防ぐために、エタノール蒸気相上に保持されます。軟部組織サンプルは、X線CT測定中にサンプルの周囲の溶媒の蓄積を回避するために溶媒と接触してはならない。サンプルホルダーが底部に溶媒を保持できない場合、70%(v/v)エタノールで湿らせたセルロース紙をサンプルホルダーに入れることができます。なお、溶媒エタノールによる収縮アーティファクトは認められなかった。注: プロトコルはここで一時停止できます。 サンプルの慎重な位置合わせの後、最高の画質のための集録パラメータを選択します。提示されたmicroCTデータの場合、50kVのピーク電圧でスキャンを取得し、1601プロジェクションを使用して3.5Wの電流を360°以上均等に分布させます。注:概要CTスキャンの集録パラメータは、最高の画質のために選択されました。このように、0.39xカメラの目的は、視野(FOV)内のサンプル全体をカバーするために選択されました。その結果、有効画素サイズは12μmとなった。投影あたり2秒の露光時間は、ノイズ比に良好な信号を提供しました。高解像度CTスキャンのROIは、概要スキャンのmicroCTデータを使用して特定されました。MicroCTスキャナには、多くの場合、統合されたソフトウェアツールが組み込まれており、決定されたROIを正確に選択できます。高解像度CTデータでは、4xカメラの目標を選択し、有効画素サイズは3.3μmになりました。ここでは、投影あたり15秒の露光時間が必要であった。注: プロトコルはここで一時停止できます。 X線CTデータを取得した後、3D体積の再構成に応じて突起を処理します。提示されたmicroCTデータの場合:統合ソフトウェアを使用してX線CTデータを再構築します。注:図 1および図 2に示す microCT データのボリューム レンダリングは、視覚化ソフトウェアを使用して生成されました。注: プロトコルはここで一時停止できます。 3. X線ナノCTイメージング メモ:X線ナノCTスキャナは社内で開発されました。レンズフリーの器械はナノフォーカスX線源および単光子計数えが装備されている。100 nmまでの解像度を持つ3Dデータは10を生成することができます。一般に、X線光学を有するものを含むnanoCTシステムは市販されており、記載のnanoCTスキャナに限定されない。 ナノCTサンプル調製 軟組織サンプルのVOIを準備します。メスとステレオ顕微鏡を使用して、柔らかいティッシュを約0.5mmのエッジ長の非常に小さな部分に切断します。マウス腎臓の場合:マウス腎臓を最も長い軸に沿って2つの半分にカットします。マウス腎臓の半分を取り、腎皮質や腎髄質などの異なる解剖学的領域を準備します。注:マウス腎臓の他の半分は組織病理学に移され、そこでサンプルはパラフィンに埋め込まれ、図3cおよび図3 dに示すように典型的な組織学的セクションを得るためにそれに応じて処理された. 最初の脱水ステップの前に小片を新しいペトリ皿に移し、その後のすべてのステップのために残ります。 濃度(すべてv/v)を%で使用してサンプルを脱水します:50、60、70、80、90、96、100エタノールと蒸留水のバランスをとります。各脱水ステップをそれぞれ1時間ずつ行う。注: プロトコルはここで一時停止できます。小さな組織片を100%エタノールに一晩入れておく。 臨界点ドライ(CPD)小さな組織片。注:CPDの適用は、乾燥剤(ここではCO2)と溶媒(ここではエタノール)を交換することにより、組織サンプルの完全な脱水を可能にします。これは、サンプルがナノCTのサンプルホルダーに取り付けることができ、測定中に動かず、X線源に非常に近い位置に配置して、最良の幾何学的倍率を可能にするために必要でした。nanoCT の設定は単なる幾何学的倍率に基づいており、倍率はソースからサンプルまでの距離に対するソースから検出器までの距離として定義されます。乾燥技術は、電子顕微鏡28のための生体標本の3D構造を保存するためにアンダーソンによって最初に導入された。テクニックの概要は、ブレイ29によって提供されています。 真空チャンバーに100%エタノールをプリフィルします。小さなティッシュ片をマイクロ多孔質カプセルに移し、CPDの真空チャンバーに入れます。メモ:CPDプロセスには高圧が関与するため、CPDのすべての部品、特に継手が無傷で、システムが正しく閉じていることを確認してください。 チャンバーを6~8°Cに冷却し、液体CO2で満たします。 攪拌しながら、2つの成分の適切な混合を可能にするために3分間待ちます。慎重にチャンバーを排水します。サンプルホルダーがまだ溶剤で覆われていることを確認します。この手順を 10 回繰り返して、エタノールをサンプル内の CO2に完全に置き換えるようにします。 CO2でチャンバーの最終充填後、機械をCO2(31°Cおよび73.8bar)の臨界点に加熱し、その後30分の時間をかけて気体CO2の非常に遅い放出を行います。メモ:ガスの放出は、そうでなければ凝縮水がサンプル上に形成することができるので、非常にゆっくりと行われるべきです。温度がCO2の臨界点を下回らないようにしてください。すべての圧力がシステムから解放された場合にのみ、CPDマシンを開きます。 CPDティッシュピースを機械から素早く取り出し、使い続ける前にデシケーターに保存された新しいペトリ皿に保管してください。注: プロトコルはここで一時停止できます。 CPDティッシュピースを適切なサンプルホルダーに取り付けます。サンプルホルダーのサンプルのしっかりとしたフィット感を確保し、CT測定中にサンプルが動かないようにします。CPDマウス腎臓組織片の場合:サンプルホルダーにスーパーグルーで組織片を接着します。メモ:CT測定中にサンプルが望ましくない動きをすると、特にナノメートルボクセルサイズのデータセットを取得する場合に、体積再構成中に問題が発生する可能性があります。注: プロトコルはここで一時停止できます。 サンプルの慎重な位置合わせの後、最高の画質のための集録パラメータを選択します。提示されたnanoCTデータの場合:1599の投影法が360°以上均等に分布し、ボクセルサイズが約400nmの60kVのピーク電圧でプロジェクションを取得します。注:400 nmボクセルサイズで取得した単一のCT測定は、回転軸(垂直)の方向に75μm、回転軸(水平)に垂直な方向に約560μmのFOVを持ちます。より大きなボリュームを調査するには、異なる垂直位置で複数のスキャンを組み合わせることで、回転軸に沿ったFOVの拡張を実現できます。さらに、局所断層撮影スキャンを実行して、グローバルCTスキャンのFOVによって与えられるよりも回転軸に垂直なサンプル直径が大きいサンプルを測定することができます。ナノCTデータは、投影あたり4秒の露光時間で取得した。そのため、データセットあたりの総取得時間は約 3.5 h でした。注: プロトコルはここで一時停止できます。 CTデータを取得した後、3D体積の再構成に応じて投影を処理します。 提示されたnanoCTデータの場合は、フラットフィールド画像を使用して取得した投影を正規化します。リチャードソン・ルーシー・デコンボリューション・アルゴリズム30、31を使用して突起の鮮明さを高める。デコンボリューションカーネルとして1ピクセルの標準偏差を持つ回転対称ガウス関数を使用します。 パガニンの位相検索アルゴリズムをシャープな画像に適用して、軟部組織のコントラストを高めます。アルゴリズムのパラメータを設定して画質32を最適化します。最先端のフィルターバックプロジェクション アルゴリズムを使用して、前処理済みの投影法を再構築します。注:図3は、約7μmの厚さの対応する組織学的セクションを使用して得られたnanoCTデータを評価します。そこで、仮想厚が約7μmの隣接する18個の隣接するナノCTスライスの最小強度投影スライスは、関連するスライス内の各ピクセルの最小値を算出することによって生成された。図 4に示す nanoCT データのボリュームをレンダリングするために、視覚化ソフトウェアを使用しました。