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Bioengineering

Immagini 3D di campioni di tessuti molli utilizzando un metodo di colorazione specifico a raggi X e tomografia computerizzata nanoscopica

Published: October 24, 2019
doi:
10.3791/60251
, , , , , , ,
1Department of Physics and Munich School of BioEngineering,Technical University of Munich, 2Department of Diagnostic and Interventional Radiology, School of Medicine and Klinikum rechts der Isar,Technical University of Munich

Summary

Viene presentato un protocollo per la visualizzazione 3D di strutture microscopiche del tessuto utilizzando un metodo di colorazione specifico a raggi X progettato per la tomografia computerizzata a raggi X.

Abstract

Dimostriamo un metodo basato su laboratorio che combina microCT a raggi X e nanoCT con una macchia a raggi X specifica, che prende di mira il citoplasma cellulare. Il protocollo descritto è facile da applicare, veloce e adatto per campioni di tessuti molli più grandi. La metodologia presentata consente la caratterizzazione delle strutture tissutali cruciali in tre dimensioni ed è dimostrata su un intero rene di topo. L’approccio multiscala permette di immaginare l’intero rene di topo e supporta la selezione di ulteriori volumi di interesse, che vengono acquisiti con risoluzioni più elevate che vanno nella gamma nanometrica. Di conseguenza, viene riprodotta la morfologia dei tessuti molli con un livello di dettaglio simile a quello delle corrispondenti immagini di microscopia immutata della luce. Approfondimenti sulla configurazione 3D delle strutture tissutali sono ottenuti senza ostacolare ulteriori indagini attraverso metodi istologici.

Introduction

La completa caratterizzazione degli esemplari di tessuto molle richiede informazioni sulla microstruttura dei tessuti 3D. L’attuale gold standard per l’analisi dei campioni di tessuti molli è l’istopatologia. La morfologia tissutale e cellulare del campione viene esplorata in 2D all’interno di regioni di interesse selezionate (ROI) utilizzando la microscopia ottica1. Questo metodo, tuttavia, presenta diversi svantaggi. La preparazione del campione richiede molto tempo, complicato, distruttivo e incline agli artefatti. I vetrini microscopici prodotti forniscono solo informazioni 2D parallele al piano di sezionamento. Spesso il numero di sezioni istologiche, che vengono studiate, è limitato a causa dei vincoli di tempo2,3.

Negli ultimi anni, il campo dell’istologia 3D si è evoluto. Qui, le fette di tessuto virtuale da qualsiasi piano spaziale desiderato sono accessibili. Ciò consente il monitoraggio delle strutture in tutto il campione, che porta a una comprensione più profonda dell’architettura dei tessuti 3D e dei cambiamenti strutturali associati a diverse patologie. Sono stati sviluppati vari metodi per ottenere la generazione di dati di volume 3D. Si va da approcci basati sulla sezione seriale, che utilizzano microscopia leggera o elettronica4,5,6,7,8, a metodi di imaging a blocchi, come l’imaging 3D episcopico o microscopia elettronica a scansione a faccia blocco7,8,9. Tutti i metodi menzionati, tuttavia, comportano la sezionamento o la distruzione completa del campione, il che non consente ulteriori indagini. La risoluzione ottenuta dipende fortemente dal processo di sezionamento che è incline agli artefatti come descritto nell’istologia convenzionale. Questi metodi soffrono anche di artefatti di allineamento.

Tecniche di imaging a raggi X 3D come la tomografia computerizzata microscopica e nanoscopica (microCT e nanoCT) aspirano a generare dati 3D ad alta risoluzione senza distruzione del campione di tessuto. Finora, il debole contrasto di attenuazione dei raggi X dei tessuti molli e il limitato accesso ad alte risoluzioni in un ambiente di laboratorio ne hanno compromesso l’uso per la visualizzazione 3D di strutture microscopiche dei tessuti. I recenti progressi verso la TAC a raggi X ad alta risoluzionee di laboratorio consentono risoluzioni ben al di sotto di 1 ,11,12,13.

La mancanza di contrasto nei tessuti molli nell’imaging a raggi X convenzionale basato sull’attenuazione è compensata da agenti di colorazione, che migliorano il contrasto dell’attenuazione dei raggi X. Gli agenti di colorazione noti da altre tecniche di imaging come il tetrossido di osmio (OsO4), lo iodio di iodio di iodio di iodio di iodio (IKI) o l’acido fosfotungstico (PTA) sono spesso utilizzati14,15,16,17, 18,19,20,21,22,23,24,25. Agenti di colorazione che consentono (i) targeting biologico specifico, (ii) colorazione omogenea e completa, (iii) facile maneggevolezza, (iv) penetrazione rapida del tessuto senza creare artefatti come anelli di diffusione, (v) colorazione dei tessuti grandi e densi e (vi) la piena compatibilità con l’istopatologia è necessaria per stabilire la TC a raggi X come strumento per la visualizzazione 3D di strutture microscopiche del tessuto. In questo lavoro, mostriamo come i campioni di tessuti molli sono preparati per l’imaging CT a raggi X con una macchia a raggi X specifica per il citoplasma basato sull’eosina che soddisfa i requisiti sopra26.

L’approccio di imaging multiscala garantisce la valutazione della qualità della colorazione attraverso una misurazione generale delle microCT e la selezione dei volumi di interesse (VOI) per ulteriori indagini ad alta risoluzione. La qualità della colorazione viene analizzata concentrandosi su parametri di colorazione come (i) completezza, (ii) aspetto degli anelli di diffusione, (iii) miglioramento del contrasto, (iv) aspetto di artefatti Ct come striature e (v) omogeneità. La configurazione nanoCT basata sul laboratorio, che utilizza l’ingrandimento geometrico per raggiungere risoluzioni fino a 100 nm, visualizza la morfologia dei tessuti molli al livello (sub)-cellulare10,27. Un’analisi comparativa delle fette nanoCT con le corrispondenti immagini di microscopia a luce istologica conferma la riproduzione dell’architettura tissutale con dettagli simili a livello microscopico in 2D, consentendo la caratterizzazione istopatologica del tessuto campione. Questo protocollo video dettagliato ha lo scopo di aumentare la consapevolezza e di evidenziare il potenziale di questa metodologia come strumento di imaging dei tessuti molli 3D non distruttivo di interesse per un’ampia comunità scientifica come zoologi, biologi e salute Professionisti.

Protocol

Attenzione: si prega di consultare tutte le schede tecniche di sicurezza dei materiali pertinenti (MSDS) prima dell’uso. Molte delle sostanze chimiche utilizzate nel protocollo sono acutamente tossiche e cancerogene. Si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate quando si esegue il protocollo di colorazione compreso l’uso di controlli di ingegneria (cappuccio di ghiaccio, scatola portaoggetti) e dispositivi di protezione personale (occhiali di sicurezza, guanti, cappotto da laboratorio, pantaloni a lunghezza intera, scarpe chiuse). Animali utilizzati:L’edilizia animale è stata effettuata presso i rechts der Isar di Klinikum, Università Tecnica di Monaco in conformità con le linee guida dell’Unione europea 2010/63. L’espianto degli organi è stato approvato da un comitato interno per la protezione degli animali di Klinikum rechts der Isar, Monaco di Baviera, Germania (numero di riferimento interno 4-005-09). Tutte le procedure erano conformi alle linee guida e ai regolamenti pertinenti. Tutti i laboratori sono ispezionati per verificare la conformità con i principi dell’OCSE delle buone pratiche di laboratorio. 1. Protocollo di colorazione Eosin Per fissare campioni di tessuti molli, riempire un tubo di centrifugadi da 50 mL con una soluzione fissativa contenente 9,5 mL del 4% (v/v) di soluzione di formaldeide (FA) e 0,5 mL di acido acetico glaciale (AA).NOTA: Preparare la soluzione FA da una soluzione FA priva di acido del 37% stabilizzata con circa il 10% di metanolo. Diluire ulteriormente la soluzione FA con la salina tamponata da fosfato di Dulbecco (DPBS). Scegli DPBS senza calcio e magnesio. Mantenere la soluzione FA diluito non più di un mese. Durante l’acidificazione il pH della soluzione fissativa sta cambiando da neutro a circa 3.AVVISO: Poiché la FA è tossica, corrosiva e cancerogena per gli organi acuti, l’uso di una cappa di fumi è obbligatorio e devono essere utilizzate attrezzature personali protettive adeguate. Aggiungere il campione di tessuto molle appena rimosso a un tubo di centrifuga di 50 mL e refrigerare il tubo di centrifuga 50 mL per 24-72h.NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Lavare il campione di tessuto molle con soluzione DPBS per 1h. Per macchiare il campione di tessuto molle fissato (ad esempio, un intero rene di topo), posizionare il tessuto molle in 2 mL di soluzione di colorazione Y eosina e incubare il campione per 24 h. Mantenere il campione su una piastra di agitazione orizzontale per una donazione liscia (ca. 60 rpm) durante l’incubazione processo.NOTA: la soluzione di colorazione Y eosin a eosina ha una concentrazione del 30% (w/v) in acqua distillata. Scegliere il volume della soluzione di colorazione in modo che il campione sia completamente coperto dalla soluzione di colorazione e consentire al campione di muoversi liberamente all’interno del contenitore del campione. Il tempo di incubazione può differire per altri campioni e deve essere regolato di conseguenza. Dopo la colorazione, rimuovere attentamente il campione di tessuto molle dal contenitore del campione. Rimuovere con attenzione l’eccesso di agente di colorazione con carta velina di cellulosa. Collocare il campione di tessuto molle in un contenitore campione conico sopra una fase di vapore di etanolo per lo stoccaggio e un ulteriore utilizzo.NOTA: Il contenitore del campione conico deve sempre contenere alcune gocce di 70% (v/v) di etanolo nella parte inferiore del tubo per mantenere il campione di tessuto molle umido e prevenire artefatti. 2. Immagini microCT a raggi X NOTA: le misurazioni microCT a raggi X sono state eseguite con uno scanner microCT, che offre misurazioni panoramiche tC (la capacità di immaginare l’intero campione nel campo visivo (FOV)) e le prestazioni delle misurazioni CT ad alta risoluzione (la capacità di su un volume di interesse desiderato (VOI) dello stesso campione) fino a 1 m. Montare il campione di tessuto molle su un supporto di campione appropriato. Assicurarsi una vestibilità rigorosa del campione sul supporto del campione per evitare che il campione si muova durante le misurazioni tC a raggi X. In caso di rene di topo colorato: Preparare un supporto campione con due tubi di centrifuga, per cui il fondo di un tubo è tagliato. Incollare i due tubi di centrifuga insieme utilizzando l’adesivo a due componenti. Assicurare un allineamento diritto dei tubi di centrifuga attorno all’asse di rotazione. Attendere che l’adesivo si indurisci. Una volta che il supporto del campione è pronto per l’uso, trasferire il rene di topo nel tubo di centrifuga intatto, che contiene alcune gocce di 70% (v/v) etanolo nella parte inferiore del tubo.NOTA: la stabilità del campione è fondamentale. Prendetevi del tempo per preparare il campione per le misurazioni TC a raggi X. Il campione di tessuto molle viene mantenuto durante una fase di vapore etanolo per mantenere il campione umido durante le misurazioni della TAC a raggi X e prevenire il restringimento del campione di tessuto molle e altri artefatti. Il campione di tessuto molle non deve essere in contatto con il solvente per eliminare l’accumulo del solvente intorno al campione durante la misurazione della TAC a raggi X, che potrebbe portare al movimento del campione durante la misurazione o potrebbe causare problemi durante la ricostruzione. Se il supporto del campione non consente di tenere il solvente sul fondo, nel supporto del campione può essere inserita una carta di cellulosa inumidita con 70% (v/v) di etanolo. Va notato che gli artefatti di restringimento a causa dell’etanolo solvente non sono stati osservati.NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Dopo un attento allineamento del campione, scegliere i parametri di acquisizione per la migliore qualità dell’immagine. Nel caso dei dati microCT presentati, acquisire la scansione ad una tensione di picco di 50 kV, una corrente di 3,5 W utilizzando 1601 proiezioni equamente distribuite su 360.NOTA: i parametri di acquisizione per la scansione CT di panoramica sono stati scelti per la migliore qualità dell’immagine. Come tale, l’obiettivo della telecamera 0.39x è stato scelto per coprire l’intero campione nel campo visivo (FOV). Ciò ha portato a una dimensione effettiva dei pixel di 12 m. Il tempo di esposizione di 2 s per proiezione ha fornito un buon rapporto segnale/rumore. Il ROI per la TAC ad alta risoluzione è stato identificato utilizzando i dati microCT della scansione panoramica. Gli scanner MicroCT spesso incorporano uno strumento software integrato, che consente la selezione precisa del ROI determinato. Per i dati CT ad alta risoluzione, l’obiettivo della telecamera 4x è stato scelto, con una dimensione effettiva in pixel di 3,3 m. Qui, era necessario un tempo di esposizione di 15 s per proiezione.NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Dopo l’acquisizione dei dati CT a raggi X, elaborare le proiezioni di conseguenza per la ricostruzione del volume 3D. Nel caso dei dati microCT presentati: ricostruire i dati CT a raggi X con il software integrato.NOTA: i rendering del volume dei dati microCT illustrati nella Figura 1 e nella Figura 2 sono stati generati utilizzando un software di visualizzazione.NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. 3. Imaging nanoCT a raggi X NOTA: lo scanner nanoCT a raggi X è stato sviluppato internamente. Lo strumento senza lenti è dotato di una sorgente di raggi X nanofocale e di un rilevatore di conteggio a singolo fotone. I dati 3D con risoluzioni fino a 100 nm possono essere generati10. In generale, i sistemi nanoCT, compresi quelli con ottica a raggi X, sono disponibili in commercio e non si limitano allo scanner nanoCT descritto. Preparazione del campione NanoCT Preparare le COVe del campione dei tessuti molli. Tagliare il tessuto molle in pezzi molto piccoli di circa 0,5 mm di lunghezza del bordo utilizzando un bisturi e uno stereomicroscopio. In caso di rene di topo: Tagliare il rene di topo in due metà lungo l’asse più lungo. Prendere metà del rene di topo e preparare diverse regioni anatomiche come corteccia renale e medulla renale.NOTA: L’altra metà del rene del topo è stata trasferita all’istopatologia, dove il campione è stato incorporato in paraffina ed elaborato di conseguenza per produrre le tipiche sezioni istologiche come si vede in Figura 3c e Figura 3d . Trasferire i piccoli pezzi prima del primo passo di disidratazione in un nuovo piatto Petri, dove rimangono per tutti i passaggi successivi. Disidratare i campioni utilizzando concentrazioni (tutte v/v) in %: 50, 60, 70, 80, 90, 96 e 100 etanolo bilanciato con acqua distillata. Eseguire ogni fase di disidratazione per 1 h ciascuno.NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Mantenere i piccoli pezzi di tessuto in etanolo al 100% durante la notte. Punto critico asciutto (CPD) i piccoli pezzi di tessuto.NOTA: l’applicazione di CPD consente la completa disidratazione del campione di tessuto scambiando il solvente (qui l’etanolo) con l’agente di essiccazione (qui CO2). Ciò è stato necessario per garantire che il campione possa essere montato sui portacampioni della nanoSCARICA, non si muova durante la misurazione e possa essere posizionato molto vicino alla sorgente di raggi X per consentire il miglior ingrandimento geometrico. La configurazione nanoCT si basa su un semplice ingrandimento geometrico, con il fattore di ingrandimento definito come la distanza da fonte a rilevatore sulla distanza da fonte a campione. La tecnica di essiccazione è stata introdotta per la prima volta da Anderson per preservare la struttura 3D dei campioni biologici per la microscopia elettronica28. Una panoramica della tecnica è fornita da Bray29. Precompilare la camera a vuoto con 100% di etanolo. Trasferire i piccoli pezzi di tessuto in una capsula micro-porosa e posizionarlo nella camera a vuoto del CPD. Chiudere il sistema.NOTA: poiché l’alta pressione è coinvolta nel processo CPD, assicurarsi che tutte le parti del CPD, in particolare i raccordi, siano intatte e che il sistema sia correttamente chiuso. Raffreddare la camera a 6- 8 gradi centigradi e riempire con CO2liquido. Durante la mescolatura, attendere 3 min per consentire una corretta miscelazione dei due componenti. Scolare con cura la camera. Assicurarsi che il supporto del campione sia ancora coperto di solvente. Ripetere questo passaggio dieci volte per consentire la sostituzione completa dell’etanolo con CO2 all’interno del campione. Dopo il riempimento finale della camera con CO2, riscaldare la macchina fino al punto critico di CO2 (31 o 73,8bar) seguito da un rilascio molto lento del COgassoso 2 in un tempo di 30 min.NOTA: Il rilascio del gas deve essere effettuato molto lentamente in quanto altrimenti l’acqua condensata può formarsi sul campione. Assicurarsi che la temperatura non scchi al di sotto del punto critico di CO2. Aprire la macchina CPD solo quando tutta la pressione è stata rilasciata dal sistema. Rimuovere rapidamente i pezzi di tessuto CPD dalla macchina e tenerli in una nuova teglia Petri conservata in un desiccatore prima di un ulteriore utilizzo.NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Montare i pezzi di tessuto CPD su un supporto campione appropriato. Assicurarsi una vestibilità rigorosa del campione sul supporto del campione per evitare che il campione si muova durante le misurazioni TC. Nel caso dei pezzi di tessuto renale del topo CPD: incollare i pezzi di tessuto con supercolla a un supporto campione.NOTA: qualsiasi movimento indesiderato del campione durante le misurazioni TC può causare problemi durante la ricostruzione del volume, specialmente quando si acquisisce un set di dati con dimensioni voxel nanometriche.NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Dopo un attento allineamento del campione, scegliere i parametri di acquisizione per la migliore qualità dell’immagine. Nel caso dei dati nanoCT presentati: Acquisire proiezioni ad una tensione di picco di 60 kV con proiezioni 1599 equamente distribuite su 360 e una dimensione voxel di circa 400 nm.NOTA: Una singola misura TC acquisita a 400 nm di dimensione voxel ha un FOV di 75 m nella direzione dell’asse di rotazione (verticale) e di circa 560 m nella direzione perpendicolare all’asse di rotazione (orizzontale). Per analizzare volumi più grandi, è possibile ottenere un’estensione del FOV lungo l’asse di rotazione combinando più scansioni in diverse posizioni verticali. Inoltre, è possibile eseguire scansioni tomografiche locali per misurare campioni con un diametro del campione più grande perpendicolare all’asse di rotazione rispetto al FOV di una TAC globale. I dati delle nanoCT sono stati acquisiti con un tempo di esposizione di 4 s per proiezione. Di conseguenza, il tempo totale di acquisizione per set di dati è stato di circa 3,5 orh.NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Dopo l’acquisizione dei dati CT, elaborare le proiezioni di conseguenza per la ricostruzione del volume 3D. Nel caso dei dati nanoCT presentati, normalizzare le proiezioni acquisite con immagini flatfield. Migliorare la nitidezza delle proiezioni utilizzando un algoritmo di deconvoluzione Richardson-Lucy30,31. Utilizzare una funzione gaussiana simmetrica a rotazione con una deviazione standard di un pixel come kernel di deconvoluzione. Applica l’algoritmo di recupero di fase di Paganin alle immagini affilate per aumentare il contrasto dei tessuti molli. Impostare i parametri dell’algoritmo per ottimizzare la qualità dell’immagine32. Ricostruisci le proiezioni pre-elaborate con un algoritmo di retroproiezione filtrata all’avanguardia.NOTA: La figura 3 valuta i dati nanoCT ottenuti con le sezioni istologiche corrispondenti, che erano spesse circa 7 m. Pertanto, sono state generate sezioni di proiezione di intensità minima di 18 fette di nanoCT adiacenti con uno spessore virtuale di circa 7 m calcolando il valore minimo per ogni pixel nelle sezioni pertinenti. È stato utilizzato un software di visualizzazione per eseguire il rendering del volume dei dati nanoCT, che viene visualizzato nella Figura 4.

Representative Results

Figura 1 Mostra le sezioni tC e il rendering del volume di dati microCT a bassa risoluzione evidenziando il miglioramento del contrasto dopo la colorazione. La figura 2 mostra le sezioni TC e il rendering del volume dei dati microCT ad alta risoluzione derivati da una tomografia locale dell’intero rene di topo. La figura 3 mostra sezioni tC di dati nanoCT rispetto alle sezioni istologiche corrispondenti. La figura 4 mostra il rendering tramite sezione TC e volume dei dati nanoCT che evidenziano i dettagli strutturali a livello cellulare. La misurazione delle microCT a bassa risoluzione consente una panoramica dell’intero organo e aiuta a identificare i volumi di interesse (VOI) per la misurazione delle microCT ad alta risoluzione. Attraverso questo approccio multiscala, viene determinato il VOI per la nanoCT. La nanoCT consente una visione molto dettagliata del campione di tessuti molli a livello cellulare. Lo studio comparativo con la corrispondente sezione istologica evidenzia la piena compatibilità con l’istopatologia. In questo caso, l’approccio dell’imaging multimodale conferma i risultati ottenuti con entrambe le modalità. come illustrato nella Figura 1. Sezioni TC e rendering del volume dei dati microCT a bassa risoluzione. (a,b) Panoramica delle immagini dello stesso rene di topo prima e dopo la colorazione, rispettivamente, evidenziando il miglioramento del contrasto ottenuto dopo l’applicazione del protocollo di colorazione basato sull’eosina. Entrambi i set di dati microCT sono stati acquisiti utilizzando parametri di acquisizione identici. La dimensione del voxel in entrambi i set di dati è di 12 m. Il miglioramento del contrasto ottenuto in (b) consente l’identificazione delle seguenti regioni strutturali anatomiche: Cortex (I), medulla esterna (II) con ulteriore distinzione nelle strisce esterne di medulla esterna (IIa) e strisce interne di medulla esterna (IIb), medulla interna (III), papilla (IV) e bacino renale (V). (c) Rendering del volume dei dati microCT che mostra una sezione sagittale virtuale attraverso l’intero rene del topo. Questa cifra è stata modificata da Busse e M’ller et al.26Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. come illustrato nella Figura 2. La sezione T e il rendering del volume di dati microCT ad alta risoluzione derivati dallo stesso rene di topo dopo l’applicazione del protocollo di colorazione basato sull’eosina sviluppato. (a) L’angolo sinistro mostra l’immagine microCT panoramica evidenziando il ROI (casella blu) per l’immagine ad alta risoluzione visualizzata. Le seguenti regioni strutturali anatomiche sono identificabili: Corteccia (I), medulla esterna (II) con ulteriore distinzione nelle strisce esterne di medulla esterna (IIa) e strisce interne di medulla esterna (IIb), medulla interna (III), cilitini minori (IV) e vasi (V e VI). (b) Rendering del volume di interesse dei dati microCT ad alta risoluzione acquisiti con una dimensione voxel di 3,3 m. Viene mostrata la regione medulla e una sezione virtuale attraverso un vaso derivato da una tomografia locale dell’intero rene. Questa cifra è stata modificata da Busse e M’ller et al.26. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. come illustrato nella figura 3. Sezioni di NanoCT (a,b) rispetto alle sezioni istologiche (c,d) derivate dallo stesso rene di topo dopo l’applicazione del protocollo di colorazione basato sull’eosina sviluppato. (a) L’immagine nanoCT dello stesso campione di rene di topo dopo la colorazione, la dissezione e la CPD mostra strutture dettagliate della regione (IIb) mostrate nella figura 1 e nella figura 2. Questi sono noti come spessi arti ascendenti del ciclo di Henle. (b) La sezione di proiezione di intensità minima derivata dallo stesso set di dati nanoCT mostrato in (a) con uno spessore di fetta virtuale di circa 7 m, che consente una chiara visualizzazione dei nuclei cellulari. (c) Sezione istologica rappresentativa con spessi arti ascendenti del ciclo di Henle con una chiara visualizzazione dei nuclei cellulari e del bordo del pennello. La sezione istologica ha uno spessore approssimativo di 7 m ed è stata ottenuta dallo stesso campione di rene di topo dopo la colorazione e l’incorporamento a base di eosina applicata in un blocco di paraffina. (d) Sezione istologica rappresentativa con applicazione di contromacchia ematossilina evidenziando i nuclei cellulari in viola. Preparazione della sezione istologica vicino alla sezione mostrata nella (c) con spessore approssimativo di 7 m. Questa cifra è stata modificata da Busse e M’ller et al.26Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. come illustrato nella Figura 4. Sezione TC e rendering del volume dei dati nanoCT. (a) L’immagine nanoCT dello stesso campione di rene di topo che mostra le strutture note come spessi arti ascendenti del ciclo di Henle. Questa è una visione dettagliata della regione (IIb) visto Figura 1 e Figura 2 acquisita da un piccolo pezzo del rene con una dimensione voxel di circa 400 nm. La preparazione del campione ha comportato la colorazione, la dissezione e la CPD. (b) Rendering volume di dati nanoCT che visualizzano la struttura 3D degli arti ascendenti spessi dei loop di Henle. Questa cifra è stata modificata da Busse e M’ller et al.26Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Attualmente, l’eosina è usata come protocollo istologico standard per etichettare il citoplasma cellulare. L’agente di colorazione viene applicato come soluzione acquosa dello 0,1% (w/v) a fette microscopiche di tessuto molle (generalmente tagliate con uno spessore di 2-10 m)33. L’applicazione di questo protocollo istologico standardizzato a campioni di tessuto 3D come un intero rene di topo non si traducono in un contrasto di attenuazione migliorato immagine TC. Da un lato, questo può essere attribuito alle basse proprietà intrinseche di attenuazione dei tessuti molli per le energie a raggi X tipicamente utilizzate di sistemi microCT basati in laboratorio. Di solito, i tessuti molli sono composti principalmente da carbonio, idrogeno, ossigeno e azoto34, e quindi non si traducono in un miglioramento del contrasto. D’altra parte, la bassa concentrazione di eosina utilizzata per la colorazione è stato il fattore limitante. Anche se una molecola di eosina contiene quattro atomi di bromuro (bromo elemento numero atomico alto con 3534), i livelli di sensibilità richiesti per l’imaging CT a raggi X non sono stati soddisfatti.

Per superare questa sfida di basso contrasto di attenuazione, sono state studiate diverse concentrazioni di eosina. Una limitazione è qui la massima solubilità dell’eosina in acqua, che è il 30% (w/v) in una soluzione acquosa. Miglior miglioramento del contrasto di attenuazione all’interno del tessuto molle è stato osservato con la più alta concentrazione di eosina, che era previsto secondo la legge Lambert-Beer. Pertanto, il protocollo di colorazione finale è stato effettuato con la massima concentrazione.

La domanda su come preparare il tessuto molle in modo ottimale a livello molecolare per la procedura di colorazione per migliorare ulteriormente il miglioramento del contrasto è stata risolta mediante regolazione del pH. In questo caso, l’acidificazione del campione di tessuto molle durante la fissazione o prima della colorazione è risultata cruciale. Ciò è stato dimostrato anche da Hong et al.35. Il maggiore accumulo di agente di colorazione all’interno del citoplasma cellulare da parte dell’acido è stato raggiunto attraverso interazioni ioniche migliorate, che sono state il risultato della protonazione delle catene laterali degli amminoacidi di proteine e peptidi presenti all’interno del citoplasma cellulare. Un risultato rappresentativo che evidenzia il miglioramento del contrasto rispetto a un campione di tessuti molli non macchiato è illustrato nella Figura 1a,b. Qui, è stata ottenuta una panoramica strutturale di un intero rene di topo che visualizza regioni anatomiche cruciali come corteccia, medulla, papilla e bacino renale.

Il protocollo di colorazione presentato è semplice da applicare e contiene solo tre passaggi. I reagenti necessari sono facilmente accessibili. Il tempo di colorazione complessivo di 24 ore è veloce per una colorazione dell’intero organo, che consente la visualizzazione 3D di campioni di tessuti molli (Figura 1c, Figura 2b e Figura 4b) in un ambiente di laboratorio a più scale verso il basso a livello cellulare. Va notato che il tempo di colorazione complessivo e il volume della soluzione di colorazione necessaria potrebbero richiedere alcuni adattamenti a seconda della natura del campione. Tuttavia, il protocollo di colorazione basato sull’eosina è adatto per la colorazione di interi organi, che consente quindi l’imaging microCT ad alta risoluzione di organi interi. Non sono stati osservati artefatti di restringimento dovuti all’etanolo solvente, che è stato utilizzato per mantenere il campione umido durante le misurazioni microCT. Sono necessari ulteriori passaggi di preparazione per l’imaging nanoCT, che consente di sforare pezzi di tessuto più piccoli recuperati dal campione originale. Per quanto riguarda le future applicazioni istopatologiche, le scansioni generali forniranno preziose informazioni sulle regioni e le strutture anatomiche alterate, che consentono la determinazione dei ROI come illustrato nella Figura 2a. Questi possono essere studiati in 3D da microCT (Figura 1c e Figura 2b) o nanoCT (Figura 4b) e valutati in 2D con istologia ( Figura3).

Un’altra forza del protocollo è vista nella piena compatibilità con l’istopatologia rispetto alla procedura di colorazione H&E. L’applicazione della procedura di colorazione basata sull’eosina ai campioni sfusi non impedisce ulteriori indagini istologiche (Figura 3), anche se la concentrazione di eosina applicata è molto più elevata rispetto alla soluzione di colorazione istologica. La sezione nanoCT con uno spessore virtuale di circa 400 nm (Figura 3a) confronta già molto bene con la sezione istologica (Figura 3c), derivata dal campione di tessuto molle corrispondente. Considerando lo spessore approssimativo di una sezione istologica con 7-10 m, la generazione di sezioni di proiezione di intensità minima dei dati nanoCT(Figura 3b),che corrispondono ad uno spessore virtuale di circa 7 m, consente un migliore confronto con la sezione istologica (Figura 3c). Qui, i nuclei cellulari sono chiaramente rivelati come area non-attenuazione come eosina specificamente macchie proteine e peptidi nel citoplasma cellulare33.

L’applicazione di un’ulteriore controcolorazione con metodi istologici standard è possibile, anche se l’ordine della colorazione rispetto alla procedura di colorazione istologica standard è stato invertito. A partire dal protocollo di colorazione basato sull’eosina sviluppato per la TC, seguito dalla controcolorazione di quelle sezioni istologiche basate sull’eosina con ematossia, consente la piena compatibilità e si traduce in una colorazione di alta qualità che mostra la forma prevista di aspetto. La colorazione cellulare dei nuclei con l’ematossina acida di Mayer è stata applicata alla sezione istologica evidenziando i nuclei cellulari in viola (Figura 3d). L’applicazione della colorazione antistologica è attualmente limitata alla macchia H. Devono essere valutate altre controcolorazioni istologiche standard come la base dell’acido periodico Schiff, elastica van Gieson o argento Gomori, nonché la compatibilità con le tecniche immunoistologiche.

Il protocollo di colorazione basato sull’eosina consente di (i) il targeting specifico del citoplasma cellulare, (ii) la colorazione omogenea e completa, (iii) facile implementazione, (iv) la penetrazione rapida del tessuto senza creare artefatti come anelli di diffusione, (v) la colorazione grandi e densi campioni di tessuti molli, e (vi) piena compatibilità con l’istopatologia per quanto riguarda la macchia H&E. Questi requisiti sono importanti per consentire la visualizzazione TC a raggi X ad alta risoluzione dei tessuti molli fino al livello cellulare. In combinazione con i dispositivi nanoCT sviluppati di recente12,36,37, generazione non distruttiva di fette istologiche virtuali che sono comparabili in contrasto e risoluzione ai dati istologici convenzionali è reso possibile. Questo approccio combinato consentirà la creazione della TAC a raggi X come strumento prezioso per la visualizzazione 3D di strutture microscopiche dei tessuti.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo il Dr. Enken Drecoll per le discussioni istologiche e il team estremamente disponibile di Excillum AB, Svezia. Riconosciamo il sostegno finanziario attraverso il DFG Cluster of Excellence Munich Center for Advanced Photonics (MAP) e il DFG Gottfried Wilhelm Leibniz Program. Inoltre, questo progetto di ricerca ha ricevuto finanziamenti dal programma europeo di ricerca e innovazione dell’Unione Orizzonte 2020 nell’ambito dell’accordo di sovvenzione Marie Skàodowska-Curie n. H2020-MSCA-IF-2015-703745-CONSALT.

Materials

50-ml centrifuge tube by Falcon VWR 734-0453
Formaldehyde solution, 37% Carl Roth CP10.2 acid-free, stabilized with ~10% MeOH
Glacial acetic acid Alfa Aesar 36289.AP
Eosin Y disodium salt Sigma-Aldrich E4382 certified by Biological Stain Commission
Phosphate Buffered Saline (PBS) Merck L1825 Dulbecco's formualtion, w/o calcium and magnesium
Sample Tubes by Nalgene Carl Roth ATK5.1
Rocking Shaker ST5 CAT 60281-0000
Cellulose tissue paper VWR 115-0600
Forceps, by USBECK Laborgeräte VWR 232-0096
Microcentrifuge tubes by Eppendorf VWR 211-2120 safe-lock, 2.0 ml
Ethanol absolute by Baker Analyzed VWR 80252500
Disposable safety scalpel by Aesculap VWR  AESCBA210
Petri dish by Sterilin VWR 391-2019
Plastic pasteur pipette Carl Roth EA68.1 graduated, 1 ml
Desiccator by Duran VWR SCOT247826954
Silicone grease by Bayer Sigma-Aldrich 85404 high-vacuum
Carbon dioxide cylinder with standpipe Linde 3700113 10 kg, short
micro-porous treatment capsule PLANO GmbH 4614 pore size 78 µm (B)
Bal-Tec CPD 030 Bal-Tec AG CO2 as drying agent
Stemi 2000-C stereomicroscope with KL 1500 LCD Zeiss this stereomicroscope has been updated(1)
Zeiss Xradia Versa 500 Zeiss this microCT scanner has been updated(2)
Avizo Fire 8.1 Thermo Fisher Scientific
PILATUS detector as part of the nanoCT scanner Dectris single-photon counting detector(4,5); there are commercially availble nanoCT systems available (6,7)
nanofocus X-ray source as part of the nanoCT scanner Excillum high-flux nanofocus X-ray transmission tube(3); there are commercially availble nanoCT systems available(6,7)
(1) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS stereomicroscopes https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/Stereomikroskope/1006> (September 06, 2019).
(2) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 510 Versa https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/zeiss-xradia-510-versa.html> (April 10, 2019).
(3) Nachtrab, F. et al. Development of a Timepix based detector for the NanoXCT project. Journal of Instrumentation 10 (11), C11009, (2015).
(4) Kraft, P. et al. Performance of single-photon-counting PILATUS detector modules. Journal of Synchrotron Radiation 16 (3), 368-375, (2009).
(5) Kraft, P. et al. Characterization and calibration of PILATUS detectors. IEEE Transactions on Nuclear Science 56 (3), 758-764, (2009).
(6) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 810 Ultra https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/xradia-810-ultra.html> (April 9 2019).
(7) Company, G. E. GE product information: Phoenix nanotom m, https://www.gemeasurement.com/sites/gemc.dev/files/geit-31344en_nanotom_m_0517.pdf> (April 10, 2019).
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References

  1. Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. . Theory and Practice of Histological Techniques. 7th edn. , (2013).
  2. Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 18 (4), 111-116 (2014).
  3. McInnes, E. Artefacts in histopathology. Comparative Clinical Pathology. 13 (3), 100-108 (2005).
  4. Andreasen, A., Drewes, A., Assentoft, J., Larsen, N. Computer-assisted alignment of standard serial sections without use of artificial land-marks. A practical approach to the utilization of incomplete information in 3-d reconstruction of the hippocampal region. Journal of Neuroscience Methods. 45 (3), 199-207 (1992).
  5. Braverman, M. S., Braverman, I. M. Three-dimensional reconstructions of objects from serial sections using a microcomputer graphics system. Journal of Investigative Dermatology. 86 (3), 290-294 (1986).
  6. Denk, W., Hortsmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
  7. Mohun, T. J., Weninger, J. W. Imaging heart development using high-resolution episcopic microscopy. Current Opinion in Genetics and Development. 21, 573-578 (2011).
  8. Weninger, J. W., Meng, S., Streicher, J., Müller, G. B. A new episcopic method for rapid 3-d reconstruction: applications in anatomy and embryology. Anatomy and Embryology. 197 (5), 341-348 (1998).
  9. Odgaard, A., Andersen, K., Melsen, F., Gundersen, H. J. G. A Direct Method for Fast 3-Dimensional Serial Reconstruction. Journal of Microscopy. 159, 335-342 (1990).
  10. Müller, M., et al. Myoanatomy of the velevt worm leg revealed by labratory-based nanofocus X-ray source tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12378-12383 (2017).
  11. Salomon, M., Hanke, R., Krüger, P., Uhlmann, N., Voland, V. Realization of a computed tomography setup to achieve resolutions below 1 µm. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A. 591, 50-53 (2008).
  12. Tkachuk, A., et al. X-ray computed tomography in Zernike phase contrast mode at 8 keV with 50-nm resolution using Cu rotating anode X-ray source. Zeitschrift für Kristallographie. 222, 650-655 (2007).
  13. Withers, P. J. X-ray nanotomography. Materials Today. 10, 26-34 (2007).
  14. Jahn, H., et al. Evaluation of contrasting techniques for X-ray imaging of velvet worms (Onychophora). Journal of Microscopy. 270 (3), 343-358 (2018).
  15. Martins de S. e Silva, J., et al. Three-dimensional non-destructive soft-tissue visualization with X-ray staining micro-tomography. Scientific Reports. 5, 14088 (2015).
  16. Metscher, B. D. MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions. Developmental Dynamics. 238, 632-640 (2009).
  17. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
  18. Mitzutani, R., et al. X-Ray Microtomographic Imaging of Three-Dimensional Structure of Soft Tissues. Tissue Engineering Part C: Methods. 14 (4), 359-363 (2008).
  19. Pauwels, E., Loo, D. v., Cornillie, P., Brabant, L., Hoorebeke, L. v. An exploratory study of contrast agents for soft tissue visualization by means of high resolution X-ray computed tomography imaging. Journal of Microscopy. 250, 21-31 (2013).
  20. Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining. Circulation: Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).
  21. Dullin, C., et al. μCT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry. PLOS ONE. 12 (2), 0170597 (2017).
  22. Jeffrey, N. S., Stephenson, R. S., Gallagher, J. A., Cox, P. Micro-computed tomography with iodine staining resolves the arrangement of muscle fibres. Journal of Biomechanics. 44, 189-192 (2011).
  23. Johnson, J. T., et al. Virtual Histology of Transgenic Mouse Embryos for High-Throughput Phenotyping. PLOS Genetics. 2, 61 (2006).
  24. Leszczyński, B., et al. Visualization and Quantitative 3D Analysis of Intraocular Melanoma and Its Vascularization in a Hamster Eye. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 332 (2018).
  25. Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Mircon. 43, 104-115 (2012).
  26. Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2293-2298 (2018).
  27. Müller, M., et al. Non-destructive high-resolution 3D virtual histology enabled through a cell nucleus-specific stain for X-ray computed tomography. Scientific Reports. 8, 17855 (2018).
  28. . ZEISS product information: ZEISS Xradia 510 Versa Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/zeiss-xradia-510-versa.html (2019)
  29. Nachtrab, F., et al. Development of a Timepix based detector for the NanoXCT project. Journal of Instrumentation. 10 (11), 11009 (2015).
  30. Kraft, P., et al. Performance of single-photon-counting PILATUS detector modules. Journal of Synchrotron Radiation. 16 (3), 368-375 (2009).
  31. Kraft, P., et al. Characterization and calibration of PILATUS detectors. IEEE Transactions on Nuclear Science. 56 (3), 758-764 (2009).
  32. . ZEISS product information: ZEISS Xradia 810 Ultra Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/zeiss-xradia-510-versa.html (2019)
  33. Anderson, T. F. Techniques for the preservation of three-dimensional structure in preparing specimens for the electron microscope. Transactions of the New York Academy of Sciences. 13 (4), 130-134 (1951).
  34. Bray, D., Williams, J. R., Clifford, A. A. . Supercritical Fluid Methods and Protocols. Methods in Biotechnology. 13, 235-243 (2000).
  35. Lucy, L. B. An iterative technique for the rectification of observed distributions. The Astronomical Journal. 79, 745-765 (1974).
  36. Richardson, W. H. Bayesian-Based Iterative Method of Image Restoration. The Journal of the Optical Society of America. 62 (1), 55-59 (1972).
  37. Paganin, F., Mayo, S. C., Gureyev, T. E., Miller, P. R., Wilkins, S. W. Simultaneous phase and amplitude extraction from a single defocused image of a homogeneous object. Journal of Microscopy. 206, 33-40 (2002).
  38. Riedelsheimer, B., Büchl-Zimmermann, S., Mulisch, M., Welsch, U. . Mikroskopische Technik. , 193-194 (2015).
  39. Hubbell, J. H., Seltzer, S. M. Tables of Xray mass attenuation coefficients and mass energy-absorption coefficients from 1 keV to 92 keV and 48 additional substances of dosimetric interest, Table 3. National Institute of Standards and Technology. , (1995).
  40. Hong, H. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. An Eosin Y Method for Protein Determination in Solution. Analytical Letters. 32 (12), 2427-2442 (1999).
  41. . GE product information: Phoenix nanotom m Available from: https://www.gemeasurement.com/sites/gemc.dev/files/geit-31344en_nanotom_m_0517.pdf (2019)
  42. Dierick, M., et al. Recent Micro-CT Scanner Developments at UGCT. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B. 324, 35-40 (2014).
  43. Kastner, J., Plank, B., Heinzl, C. Advanced X computed tomography methods: High resolution CT, quantitative CT, 4DCT and phase contrast CT. Proceedings of Digital Industrial Radiology and Computed Tomography. , 120-132 (2015).

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Busse, M., Müller, M., Kimm, M. A., Ferstl, S., Allner, S., Achterhold, K., Herzen, J., Pfeiffer, F. 3D Imaging of Soft-Tissue Samples using an X-ray Specific Staining Method and Nanoscopic Computed Tomography. J. Vis. Exp. (152), e60251, doi:10.3791/60251 (2019).
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