التصوير ثلاثي الابعاد لعينات الانسجه الرخوة باستخدام طريقه تلطيخ محدده للاشعه السينية ونانوسكوبيك المقطعية المحوسبة
Summary
يتم تقديم بروتوكول لتصور ثلاثي الابعاد للهياكل النسيجية المجهرية باستخدام طريقه تلطيخ محدده للاشعه السينية مصممه للتصوير المقطعي المحوسب بالاشعه السينية.
Abstract
ونحن نظهر طريقه المختبر القائم علي الجمع بين ميكروكت الاشعه السينية و nanoCT مع محدده الاشعه السينية وصمه عار, التي تستهدف سيتوتوبلاسما الخلية. البروتوكول الموصوف سهل التطبيق ، سريع ومناسب لعينات الانسجه الرخوة الأكبر. وتتيح المنهجية المعروضة توصيف الهياكل الحيوية للانسجه في ثلاثه ابعاد وتظهر في كليه الفئران بأكملها. يسمح المقاربة [مولتيسكل] ان صوره الكاملة فاره كليه ويساند الانتقاء من حجوم بعيده فائده, اي يكون اكتسبت مع قرارات [هيغر] يتراوح داخل ال [نمتر] مدي. التالي ، فان شكل الانسجه الرخوة مع مستوي مماثل من التفصيل كما يتم استنساخ الصور المجهرية الضوء النسيجي المقابلة. يتم تحقيق رؤى أعمق في التكوين 3D من هياكل الانسجه دون عرقله المزيد من التحقيقات من خلال أساليب النسيجية.
Introduction
التوصيف الكامل لعينات الانسجه الرخوة يتطلب معلومات حول البنية المجهرية للانسجه ثلاثية الابعاد. المعيار الذهبي الحالي للتحليلات عينه الانسجه الرخوة هو التشريح. يتم استكشاف الانسجه والمورفولوجية الخلوية للعينه في 2D داخل مناطق مختاره من الفائدة (ROIs) باستخدام المجهر الضوئي1. هذا الأسلوب ، ومع ذلك ، لديه العديد من العيوب. اعداد العينة مضيعه للوقت ومعقده ومدمره وعرضه للتحف. تقدم الشرائح المجهرية المنتجة فقط معلومات ثنائيه الابعاد موازيه للطائرة التي يتم التزويد بها. غالبا ما يكون عدد الأقسام النسيجية ، التي يتم التحقيق فيها ، مقيدا بسبب ضيق الوقت2،3.
في السنوات الاخيره ، وقد تطورت في مجال الانسجه 3D. هنا ، يمكن الوصول إلى شرائح الانسجه الظاهرية من اي طائره المكانية المطلوبة. وهذا يسمح لتتبع الهياكل في جميع انحاء العينة ، مما يؤدي إلى فهم أعمق للهندسة النسيج 3D والتغييرات الهيكلية المرتبطة بالامراض المختلفة. وقد تم تطوير أساليب مختلفه لتحقيق توليد البيانات حجم 3D. وهي تتراوح من النهج التسلسلي القائم علي القسم ، والتي تستخدم اما الضوء أو المجهر الكترون4،5،6،7،8، إلى طرق التصوير كتله الوجه ، مثل ابيسكوبيك 3d التصوير أو كتله الوجه مسح الكترون المجهر7،8،9. ومع ذلك ، فان جميع الأساليب المذكورة تنطوي اما علي التماس العينة أو تدميرها تماما ، مما لا يسمح باجراء مزيد من التحقيقات. القرار الذي تم الحصول عليه يعتمد بشكل كبير علي عمليه التقسيم كونها عرضه للتحف كما هو موضح في الانسجه التقليدية. هذه الأساليب تعاني أيضا من التحف المحاذاة.
وتطمح تقنيات التصوير بالاشعه السينية ثلاثية الابعاد مثل الصور المقطعية المجهرية والنانوسكوبيكه (microCT و nanoCT) إلى توليد بيانات ثلاثية الابعاد عاليه الدقة دون تدمير عينه الانسجه. وحتى الآن ، فان التباين الضعيف في التوهين بالاشعه السينية للانسجه الرخوة ومحدوديه الوصول إلى القرارات العالية في بيئة مختبريه قد أعاق استخدامها لتصور ثلاثي الابعاد لهياكل الانسجه المجهرية. والتقدم الذي أحرز مؤخرا في التصوير المقطعي المحوسب للاشعه السينية المستند إلى المختبرات يسمح باتخاذ قرارات اقل بكثير من 1 μm10و11و12و13.
ويعوض عدم وجود تباين في الانسجه الرخوة في التصوير بالاشعه السينية التقليدية التي تستند إلى التوهين بعوامل تلطيخ ، مما يعزز تباين التوهين بالاشعه السينية. وغالبا ما تستخدم عوامل تلطيخ المعروفة من تقنيات التصوير الأخرى مثل الاوزميوم أكسيد (اوسو4) ، يوديد اليود البوتاسيوم (IKI) أو حمض فوسففوتونجوتيك (PTA)14،15،16،17، 18،19،20،21،22،23،24،25. عوامل تلطيخ التي تسمح ل ‘ 1 ‘ الاستهداف البيولوجي المحدد ، ‘ 2 ‘ التلطيخ المتجانس والكامل ، ‘ 3 ‘ سهوله المناولة ، ‘ 4 ‘ التغلغل السريع للانسجه دون إنشاء قطع أثريه مثل حلقات النشر ، ‘ 5 ‘ تلطيخ الانسجه الكبيرة والكثيفة ، و ‘ 6 ‘ التوافق الكامل مع علم الأورام مطلوب لإنشاء CT الاشعه السينية كاداه لتصور 3D من هياكل الانسجه المجهرية. في هذا العمل ، ونحن نظهر كيف يتم اعداد عينات الانسجه الرخوة للتصوير بالاشعه السينية التصوير المقطعي المحوسب مع وصمه السينية الخاصة بالاشعه السينية علي أساس يوزين التي تفي بالمتطلبات المذكورة أعلاه26.
ويضمن نهج التصوير المتعدد المقاييس تقييم جوده التلطيخ من خلال القياس العام للقياس المجهري واختيار احجام الفائدة (VOIs) لاجراء مزيد من التحقيقات العالية الدقة. يتم تحليل نوعيه تلطيخ التركيز علي المعلمات تلطيخ مثل (ط) اكتمال ، ‘ 2 ‘ ظهور حلقات الانتشار ، ‘ 3 ‘ تعزيز التباين ، ‘ 4 ‘ ظهور القطع الاثريه CT مثل الشرائط و (5) التجانس. الاعداد nanoct المستندة إلى المختبر, الذي يستخدم التكبير هندسية للوصول إلى القرارات وصولا إلى 100 nm, تصور المورفولوجية الانسجه الرخوة علي (sub)-مستوي الخلوية10,27. التحليل المقارن لشرائح nanoCT مع الصور المجهرية المجهر الضوئي المقابلة يؤكد استنساخ الهندسة المعمارية الانسجه مع التفاصيل مماثله علي المستوي المجهري في 2D ، وتمكين توصيف الانسجه النسيجية عينه. ويهدف هذا البروتوكول الفيديو مفصله لرفع مستوي الوعي وتسليط الضوء علي إمكانات هذه المنهجية كاداه غير مدمره 3D التصوير الانسجه الرخوة التي تهم المجتمع العلمي واسعه مثل علماء الاحياء وعلماء الاحياء والصحة المهنيين.
Protocol
Representative Results
Discussion
حاليا ، يتم استخدام يوزين كبروتوكول النسيجية القياسية لتسميه سيتوتوبلاسما الخلية. يتم تطبيق عامل تلطيخ كما 0.1 ٪ (ث/الخامس) محلول مائي لشرائح المجهرية من الانسجه الرخوة (قطع عموما مع سمك 2-10 μm)33. تطبيق هذا البروتوكول النسيجي الموحد إلى عينات الانسجه ثلاثية الابعاد مثل كليه الماوس كله لا يؤدي إلى زيادة التباين التوهين صوره CT. فمن ناحية ، يمكن ان يعزي ذلك إلى انخفاض خصائص التوهين المتاصل في الانسجه الرخوة بالنسبة لطاقات الاشعه السينية المستخدمة عاده في أنظمه microCT المستندة إلى المختبرات. عاده ، يتكون النسيج الرخو من الكربون بشكل رئيسي ، والهيدروجين ، والأكسجين والنيتروجين34، التالي ، لا يؤدي إلى تعزيز التباين. من ناحية أخرى ، كان التركيز المنخفض من يوزين المستخدمة لتلطيخ العامل المقيد. وعلي الرغم من ان جزيء ايوسين واحد يحمل أربع ذرات بروميد (البروم عنصر الرقم الذري عاليه مع Z = 3534) ، لم يتم استيفاء مستويات الحساسية المطلوبة للتصوير بالاشعه السينية التصوير المقطعي المحوسب.
وللتغلب علي هذا التحدي المتمثل في تباين التوهين المنخفض ، تم التحقيق في عده تركيزات من الايوسين. الحد هنا هو الحد الأقصى للذوبان في الماء ، وهو 30% (w/v) في محلول مائي. ولوحظ أفضل تعزيز التباين التوهين داخل الانسجه الرخوة مع تركيز ايوسين اعلي ، والذي كان متوقعا وفقا لقانون لامبرت البيره. ولذلك ، تم تنفيذ بروتوكول تلطيخ النهائي مع اعلي تركيز.
تم الرد علي السؤال كيفيه اعداد الانسجه الرخوة علي الأمثل علي المستوي الجزيئي لاجراء تلطيخ لزيادة تحسين التباين تعزيز التعديل pH. هنا ، تم العثور علي تحمض من عينه الانسجه الرخوة اثناء التثبيت أو قبل تلطيخ لتكون حاسمه. وقد اظهر ذلك أيضا هونغ وآخرون35. وقد تحقق تراكم اعلي من عامل تلطيخ داخل الخلايا الخلوية بالحمض من خلال التفاعلات الايونيه المحسنة ، والتي كانت نتيجة لل protonation من الأحماض الامينيه سلاسل الجانب من البروتينات الببتيدات الموجودة داخل سيتوتوبلاسما الخلية. ويرد في الشكل 1(ا) (ب) نتيجة تمثيليه تسلط الضوء علي تعزيز التباين بالمقارنة مع عينه من الانسجه الرخوة غير الملونة. هنا ، تم تحقيق نظره عامه هيكليه لكليه الفئران بأكملها تصور المناطق التشريحية الحاسمة مثل القشرة ، النخاع ، الحليمة والحوض الكلوي.
بروتوكول تلطيخ المقدمة هو بسيط لتطبيق ويحتوي علي ثلاث خطوات فقط. الكواشف المطلوبة يمكن الوصول اليها بسهوله. الوقت تلطيخ عموما من 24 ساعة سريعة لتلطيخ الجهاز كله ، والتي تمكن التصور 3d من عينات الانسجه الرخوة (الشكل 1ج، الشكل 2ب والشكل 4ب) في بيئة مختبريه في مقاييس متعددة وصولا إلى المستوي الخلوي. وتجدر الاشاره إلى ان الوقت تلطيخ عموما وحجم الحل تلطيخ اللازمة قد تطلب بعض التعديلات تبعا لطبيعة العينة. ومع ذلك ، فان بروتوكول تلطيخ علي أساس eosin هو مناسبه لتلطيخ الجهاز كله ، والتي تمكن بعد ذلك عاليه الدقة التصوير microCT من الأعضاء بأكملها. ولم يلاحظ انكماش التحف بسبب الايثانول المذيب ، الذي كان يستخدم للحفاظ علي عينه رطبه خلال قياسات microCT. مطلوب خطوات اعداد اضافيه للتصوير nanoCT ، والذي يسمح للتحقيق في قطع الانسجه الصغيرة المستخرجة من العينة الاصليه. وفيما يتعلق بالتطبيقات المستقبلية المرضية ، فان فحص النظرة العامة سيوفر رؤى قيمه في المناطق والهياكل التشريحية المتغيرة ، مما يسمح بتحديد المعدلات البديلة كما هو موضح في الشكل 2ا. ويمكن دراستها في 3D بواسطة microCT (الشكل 1ج والشكل 2ب) أو nanoct (الشكل 4ب) وتقييمها في 2d مع الانسجه (الشكل 3).
وينظر إلى قوه أخرى من البروتوكول في التوافق الكامل مع علم التشريح فيما يتعلق باجراء تلطيخ H & E. تطبيق اجراء تلطيخ علي أساس يوزين لعينات السائبة لا يعوق المزيد من التحقيقات النسيجية (الشكل 3) ، علي الرغم من ان تركيز يوزين التطبيقية هو اعلي بكثير مقارنه مع حل تلطيخ النسيجية. شريحة nanoct مع سمك الظاهري من حوالي 400 نانومتر (الشكل 3ا) يقارن بالفعل بشكل جيد جدا مع القسم النسيجي (الشكل 3ج) ، الذي استمد من عينه الانسجه الرخوة المقابلة. بالنظر إلى السماكة التقريبية للقسم النسيجي مع 7-10 μm ، وتوليد شرائح الإسقاط شده الحد الأدنى من البيانات nanoCT (الشكل 3ب) ، والتي تتوافق مع سمك الظاهري من حوالي 7 μm ، ويسمح مقارنه أفضل مع القسم النسيجي (الشكل 3ج). هنا ، يتم الكشف عن نوى الخلية بوضوح كمنطقه غير التوهين كما يوزين البقع علي وجه التحديد البروتينات والببتيدات في الخلية سيتوتوبلاسما33.
تطبيق المزيد من تلطيخ العداد مع الأساليب النسيجية القياسية هو ممكن ، علي الرغم من ان يتم عكس ترتيب تلطيخ مقارنه بالاجراء تلطيخ النسيجية القياسية. بدءا من البداية مع بروتوكول تلطيخ القائم علي eosin المتقدمة لل CT ، تليها تلطيخ العداد من تلك الأقسام النسيجية القائمة علي eosin مع الهيلوكسيلين ، ويسمح للتوافق الكامل والنتائج في تلطيخ عاليه الجودة عرض النموذج المتوقع من المظهر. تم تطبيق تلطيخ نواه الخلية الخاصة مع هيتوكيللين ماير في القسم النسيجي تسليط الضوء علي نوى الخلية في الأرجواني (الشكل 3د). تطبيق تلطيخ مكافحه النسيجية يقتصر حاليا علي H-وصمه عار. القياسية الأخرى النسيجية مكافحه المطاط مثل الدوري الحمضية قاعده شيف ، الاشرطه المطاطية فان Gieson أو Gomori الفضة يجب ان يتم تقييمها ، فضلا عن التوافق مع تقنيات ايمونوهيستولوجيكال يحتاج إلى اختبار.
يسمح بروتوكول تلطيخ المستندة إلى eosin ل ‘ 1 ‘ الخلايا الخلوية-استهداف محدده ، ‘ 2 ‘ تلطيخ متجانسة وكامله ، ‘ 3 ‘ سهوله التنفيذ ، ‘ 4 ‘ اختراق سريع للانسجه دون خلق التحف مثل حلقات النشر ، (v) تلطيخ عينات الانسجه الرخوة الكبيرة والكثيفة ، و (6) التوافق الكامل مع علم الامراض الحميدة فيما يتعلق وصمه عار & E. هذه المتطلبات الهامه للسماح عاليه الدقة التصوير المقطعي المحوسب الاشعه السينية من الانسجه الرخوة وصولا إلى المستوي الخلوي. بالاشتراك مع أجهزه nanoct المطورة حديثا12،36،37، الجيل غير التدميري من الشرائح النسيجية الظاهرية التي يمكن مقارنتها في التباين والدقة بالبيانات النسيجية التقليدية أصبح ممكنا. سيمكن هذا النهج المشترك من إنشاء الاشعه السينية المقطعية كاداه قيمه لتصور ثلاثي الابعاد للهياكل النسيجية المجهرية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور انكين دركول علي المناقشات النسيجية والفريق المتعاون للغاية في Excillum AB ، السويد. ونحن نعترف بالدعم المالي من خلال مجموعه DFG للتميز مركز ميونيخ للضوئيات المتقدمة (MAP) وبرنامج DFG غوتفريد فيلهلم لايبنتز. وعلاوة علي ذلك ، تلقي هذا المشروع البحثي تمويلا من برنامج الاتحاد الأوروبي للبحوث والابتكارات ال2020ه في اطار مبادرة ماري سكوودوسكا-كوري للمنح رقم مبادرة أفق 2020-MSCA-IF-2015-703745-كونسول.
Materials
| 50-ml centrifuge tube by Falcon | VWR | 734-0453 | |
| Formaldehyde solution, 37% | Carl Roth | CP10.2 | acid-free, stabilized with ~10% MeOH |
| Glacial acetic acid | Alfa Aesar | 36289.AP | |
| Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E4382 | certified by Biological Stain Commission |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | Dulbecco's formualtion, w/o calcium and magnesium |
| Sample Tubes by Nalgene | Carl Roth | ATK5.1 | |
| Rocking Shaker ST5 | CAT | 60281-0000 | |
| Cellulose tissue paper | VWR | 115-0600 | |
| Forceps, by USBECK Laborgeräte | VWR | 232-0096 | |
| Microcentrifuge tubes by Eppendorf | VWR | 211-2120 | safe-lock, 2.0 ml |
| Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
| Disposable safety scalpel by Aesculap | VWR | AESCBA210 | |
| Petri dish by Sterilin | VWR | 391-2019 | |
| Plastic pasteur pipette | Carl Roth | EA68.1 | graduated, 1 ml |
| Desiccator by Duran | VWR | SCOT247826954 | |
| Silicone grease by Bayer | Sigma-Aldrich | 85404 | high-vacuum |
| Carbon dioxide cylinder with standpipe | Linde | 3700113 | 10 kg, short |
| micro-porous treatment capsule | PLANO GmbH | 4614 | pore size 78 µm (B) |
| Bal-Tec CPD 030 | Bal-Tec AG | CO2 as drying agent | |
| Stemi 2000-C stereomicroscope with KL 1500 LCD | Zeiss | this stereomicroscope has been updated(1) | |
| Zeiss Xradia Versa 500 | Zeiss | this microCT scanner has been updated(2) | |
| Avizo Fire 8.1 | Thermo Fisher Scientific | ||
| PILATUS detector as part of the nanoCT scanner | Dectris | single-photon counting detector(4,5); there are commercially availble nanoCT systems available (6,7) | |
| nanofocus X-ray source as part of the nanoCT scanner | Excillum | high-flux nanofocus X-ray transmission tube(3); there are commercially availble nanoCT systems available(6,7) | |
| (1) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS stereomicroscopes https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/Stereomikroskope/1006> (September 06, 2019). | |||
| (2) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 510 Versa https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/zeiss-xradia-510-versa.html> (April 10, 2019). | |||
| (3) Nachtrab, F. et al. Development of a Timepix based detector for the NanoXCT project. Journal of Instrumentation 10 (11), C11009, (2015). | |||
| (4) Kraft, P. et al. Performance of single-photon-counting PILATUS detector modules. Journal of Synchrotron Radiation 16 (3), 368-375, (2009). | |||
| (5) Kraft, P. et al. Characterization and calibration of PILATUS detectors. IEEE Transactions on Nuclear Science 56 (3), 758-764, (2009). | |||
| (6) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 810 Ultra https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/xradia-810-ultra.html> (April 9 2019). | |||
| (7) Company, G. E. GE product information: Phoenix nanotom m, https://www.gemeasurement.com/sites/gemc.dev/files/geit-31344en_nanotom_m_0517.pdf> (April 10, 2019). |
References
- Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. . Theory and Practice of Histological Techniques. 7th edn. , (2013).
- Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 18 (4), 111-116 (2014).
- McInnes, E. Artefacts in histopathology. Comparative Clinical Pathology. 13 (3), 100-108 (2005).
- Andreasen, A., Drewes, A., Assentoft, J., Larsen, N. Computer-assisted alignment of standard serial sections without use of artificial land-marks. A practical approach to the utilization of incomplete information in 3-d reconstruction of the hippocampal region. Journal of Neuroscience Methods. 45 (3), 199-207 (1992).
- Braverman, M. S., Braverman, I. M. Three-dimensional reconstructions of objects from serial sections using a microcomputer graphics system. Journal of Investigative Dermatology. 86 (3), 290-294 (1986).
- Denk, W., Hortsmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
- Mohun, T. J., Weninger, J. W. Imaging heart development using high-resolution episcopic microscopy. Current Opinion in Genetics and Development. 21, 573-578 (2011).
- Weninger, J. W., Meng, S., Streicher, J., Müller, G. B. A new episcopic method for rapid 3-d reconstruction: applications in anatomy and embryology. Anatomy and Embryology. 197 (5), 341-348 (1998).
- Odgaard, A., Andersen, K., Melsen, F., Gundersen, H. J. G. A Direct Method for Fast 3-Dimensional Serial Reconstruction. Journal of Microscopy. 159, 335-342 (1990).
- Müller, M., et al. Myoanatomy of the velevt worm leg revealed by labratory-based nanofocus X-ray source tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12378-12383 (2017).
- Salomon, M., Hanke, R., Krüger, P., Uhlmann, N., Voland, V. Realization of a computed tomography setup to achieve resolutions below 1 µm. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A. 591, 50-53 (2008).
- Tkachuk, A., et al. X-ray computed tomography in Zernike phase contrast mode at 8 keV with 50-nm resolution using Cu rotating anode X-ray source. Zeitschrift für Kristallographie. 222, 650-655 (2007).
- Withers, P. J. X-ray nanotomography. Materials Today. 10, 26-34 (2007).
- Jahn, H., et al. Evaluation of contrasting techniques for X-ray imaging of velvet worms (Onychophora). Journal of Microscopy. 270 (3), 343-358 (2018).
- Martins de S. e Silva, J., et al. Three-dimensional non-destructive soft-tissue visualization with X-ray staining micro-tomography. Scientific Reports. 5, 14088 (2015).
- Metscher, B. D. MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions. Developmental Dynamics. 238, 632-640 (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
- Mitzutani, R., et al. X-Ray Microtomographic Imaging of Three-Dimensional Structure of Soft Tissues. Tissue Engineering Part C: Methods. 14 (4), 359-363 (2008).
- Pauwels, E., Loo, D. v., Cornillie, P., Brabant, L., Hoorebeke, L. v. An exploratory study of contrast agents for soft tissue visualization by means of high resolution X-ray computed tomography imaging. Journal of Microscopy. 250, 21-31 (2013).
- Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining. Circulation: Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).
- Dullin, C., et al. μCT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry. PLOS ONE. 12 (2), 0170597 (2017).
- Jeffrey, N. S., Stephenson, R. S., Gallagher, J. A., Cox, P. Micro-computed tomography with iodine staining resolves the arrangement of muscle fibres. Journal of Biomechanics. 44, 189-192 (2011).
- Johnson, J. T., et al. Virtual Histology of Transgenic Mouse Embryos for High-Throughput Phenotyping. PLOS Genetics. 2, 61 (2006).
- Leszczyński, B., et al. Visualization and Quantitative 3D Analysis of Intraocular Melanoma and Its Vascularization in a Hamster Eye. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 332 (2018).
- Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Mircon. 43, 104-115 (2012).
- Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2293-2298 (2018).
- Müller, M., et al. Non-destructive high-resolution 3D virtual histology enabled through a cell nucleus-specific stain for X-ray computed tomography. Scientific Reports. 8, 17855 (2018).
- . ZEISS product information: ZEISS Xradia 510 Versa Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/zeiss-xradia-510-versa.html (2019)
- Nachtrab, F., et al. Development of a Timepix based detector for the NanoXCT project. Journal of Instrumentation. 10 (11), 11009 (2015).
- Kraft, P., et al. Performance of single-photon-counting PILATUS detector modules. Journal of Synchrotron Radiation. 16 (3), 368-375 (2009).
- Kraft, P., et al. Characterization and calibration of PILATUS detectors. IEEE Transactions on Nuclear Science. 56 (3), 758-764 (2009).
- . ZEISS product information: ZEISS Xradia 810 Ultra Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/zeiss-xradia-510-versa.html (2019)
- Anderson, T. F. Techniques for the preservation of three-dimensional structure in preparing specimens for the electron microscope. Transactions of the New York Academy of Sciences. 13 (4), 130-134 (1951).
- Bray, D., Williams, J. R., Clifford, A. A. . Supercritical Fluid Methods and Protocols. Methods in Biotechnology. 13, 235-243 (2000).
- Lucy, L. B. An iterative technique for the rectification of observed distributions. The Astronomical Journal. 79, 745-765 (1974).
- Richardson, W. H. Bayesian-Based Iterative Method of Image Restoration. The Journal of the Optical Society of America. 62 (1), 55-59 (1972).
- Paganin, F., Mayo, S. C., Gureyev, T. E., Miller, P. R., Wilkins, S. W. Simultaneous phase and amplitude extraction from a single defocused image of a homogeneous object. Journal of Microscopy. 206, 33-40 (2002).
- Riedelsheimer, B., Büchl-Zimmermann, S., Mulisch, M., Welsch, U. . Mikroskopische Technik. , 193-194 (2015).
- Hubbell, J. H., Seltzer, S. M. Tables of Xray mass attenuation coefficients and mass energy-absorption coefficients from 1 keV to 92 keV and 48 additional substances of dosimetric interest, Table 3. National Institute of Standards and Technology. , (1995).
- Hong, H. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. An Eosin Y Method for Protein Determination in Solution. Analytical Letters. 32 (12), 2427-2442 (1999).
- . GE product information: Phoenix nanotom m Available from: https://www.gemeasurement.com/sites/gemc.dev/files/geit-31344en_nanotom_m_0517.pdf (2019)
- Dierick, M., et al. Recent Micro-CT Scanner Developments at UGCT. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B. 324, 35-40 (2014).
- Kastner, J., Plank, B., Heinzl, C. Advanced X computed tomography methods: High resolution CT, quantitative CT, 4DCT and phase contrast CT. Proceedings of Digital Industrial Radiology and Computed Tomography. , 120-132 (2015).
