Un modèle d'expression ectopique de chemokine pour tester le recrutement de macrophage in Vivo
Summary
Pour tester l’effet d’une chimiokine sur le recrutement de macrophages in vivo, l’hybridation in situ de montage entière a été employée pour détecter l’expression ectopique de la chimiokine, et l’immunostaining a été employée pour étiqueter des macrophages. L’imagerie en direct a été utilisée pour l’observation en temps réel de la migration des macrophages.
Abstract
Le poisson zèbre est largement utilisé dans la recherche fondamentale et biomédicale. De nombreuses lignées transgéniques de poissons zèbres sont actuellement disponibles pour étiqueter divers types de cellules. En raison du corps embryonnaire transparent du poisson zèbre, il est commode pour nous d’étudier l’effet d’une chimiokine sur le comportement d’un certain type de cellules in vivo. Ici nous avons fourni un workflow pour étudier la fonction d’une chimiokine sur la migration de macrophage in vivo. Nous avons construit un plasmide de surexpression spécifique aux tissus pour surexprimer l’IL-34 et injecté le plasmide dans des embryons de poissons transgéniques à un stade cellulaire dont les macrophages ont été spécifiquement étiquetés par une protéine fluorescente. Nous avons ensuite utilisé l’hybridation in situ fluorescente de montage entier et l’immunostaining pour détecter le modèle de l’expression de chemokine et le nombre ou l’emplacement des macrophages. Les embryons WT injectés ont été élevés pour générer une lignée transgénique stable. Enfin, nous avons utilisé la formation image vivante confocale pour observer directement le comportement de macrophage dans le poisson transgénique stable pour étudier la fonction de l’IL-34 sur des macrophages in vivo.
Introduction
Le poisson zèbre est un petit poisson d’eau douce tropical à os durs originaire de l’Inde. En ce qui concerne la conservation des gènes, le poisson zèbre ont une similitude de 87% à l’homme1. Il peut nous fournir des informations sur des sujets connexes de l’homme en étudiant la régulation des gènes, la fonction des protéines et le comportement cellulaire tels que la migration, la prolifération et.al chez le poisson zèbre. L’embryon de poisson zèbre peut être utilisé pour observer le développement des embryons précoces à différents stades après avoir inhibé le pigment. Pendant ce temps, il ne faut que trois mois pour que le poisson zèbre se développe en maturité sexuelle, puis le poisson zèbre peut produire des centaines d’œufs tous les 4 jours. Mini-taille, reproduction simple, forte capacité de reproduction, ces avantages rendent la culture du poisson zèbre très économe en espace, propice à la culture à grande échelle. La souris modèle mammifère traditionnelle a des coûts d’entretien plus élevés que le poisson zèbre, limitant ainsi l’échelle de l’élevage de souris. Dans l’aspect du développement précoce de l’embryon, l’embryon de souris est difficile à observer en état vivant en raison des caractéristiques du développement de l’embryon de souris dans l’utérus de la mère. Au contraire, les embryons de poissons zèbres se développent à l’extérieur et sont transparents, donc ils sont faciles à observer au microscope. En outre, le poisson zèbre est très facile de construire une variété de lignes transgéniques pour la recherche sur la fonction génique connexe. Actuellement, diverses lignées transgéniques de poisson zèbre sont disponibles pour étiqueter différents types de cellules. Il est très pratique maintenant de construire des lignes transgéniques pour surexprimer les chimiolines dans des endroits spécifiques et d’étudier la fonction de chemokines sur le comportement cellulaire chez le poisson zèbre.
Ici, nous avons fourni un flux de travail pour utiliser la ligne transgénique de poisson zèbre pour étudier la fonction de l’IL-34 sur le comportement de macrophage in vivo2,3,4,5,6,7. Tout d’abord, nous avons construit un plasmide de surexpression spécifique au foie du gène il34 et injecté le plasmide dans un stade à cellule Tg (mpeg1: GFP) embryons de poissons qui ont spécifiquement étiqueté les macrophages par la protéine fluorescente GFP. Ensuite, nous avons utilisé l’hybridation in situ fluorescente de montage entier et l’immunostaining pour détecter le modèle de l’expression il34 et le nombre ou l’emplacement des macrophages. Les embryons WT injectés ont été élevés pour générer une lignée transgénique stable. Dans ces étapes, nous avons établi et validé la ligne de cytokine-productrice et avons évalué visuellement les effets qui peuvent être vus sur la distribution de macrophage. Enfin, pour étudier le comportement de macrophage en réponse à la cytokine, nous avons employé la formation image vivante confocale pour observer directement la migration de macrophage pour confirmer la fonction d’il34 sur la migration de macrophage in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici nous permet d’étudier la fonction d’une chimiokine sur le comportement de la macrophagein vivo et la procédure nécessite une certaine expertise technique. En résumé, il y a plusieurs étapes critiques pour éviter des complications dans le protocole : 1) sélectionnez une ligne transgénique appropriée qui montre le signal transgénique spécifique et fort pour étiqueter la cellule d’intérêt ; 2) sélectionner un tissu approprié qui est accessible pour l’imagerie et la surexpression des…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Jingrong Peng d’avoir partagé la ligne transgénique Tg (fabp10a: DsRed); Dr. Zilong Wen pour le partage des lignes transgéniques Tg (mpeg1: GFP); Dr. Koichi Kawakami pour fournir le vecteur pTol2. Ces travaux ont été soutenus par la National Natural Science Foundation of China (31771594), les projets du Guangdong Science and Technology Plan (2019A030317001) et les Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales (D2191450).
Materials
| Antibody | |||
| Alexa 488-Anti-Goat antibody | Invitrogen | A11055 | |
| Anti-Digoxigenin-HRP | perkinelmer | NEF832001EA | |
| Goat-Anti-GFP antibody | Abcam | ab6658 | |
| Reagent | |||
| CaCl2· 2H2O | Sigma | 21097 | |
| Cyanine 3 Plus Amplification Reagent | perkinelmer | NEL745001KT | |
| E2 solution | 15 mM NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 µM KH2PO4 + 50 µM Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3 | ||
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Life | 10099-133 | |
| formamide | Diamond | A100314 | |
| glycerol | Sigma | V900860 | |
| heparin sodium | Sigma | H3149 | |
| hybridization buffer(HB) | 50% formamide+ 5×SSC+9 mM sodium citrate+50 μg/ml heparin sodium+ 500 μg/ml tRNA+ 0.1% Tween20 | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| low melting agarose | Sigma | A9414 | |
| methanol | GHTECH | 1.17112.023 | |
| methylene blue | Sigma | M9140 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| paraformaldehyde(PFA) | Sigma | 158127 | Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 °C to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 °C. Caution. Manipulate with mask. |
| 10×PBS | 14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O | ||
| phenylthiourea(PTU) | Sigma | P7629 | |
| 1×Plus Amplification Diluent | perkinelmer | NEL745001KT | |
| Proteinase K | Fermentas | E00492 | |
| 20×Saline sodium citrate(SSC) | 175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0 | ||
| sodium citrate | Sigma | A5040 | |
| tricaine | Sigma | E10521 | |
| tRNA | Sigma | R6625 | |
| Tween20 | Sigma | P2287 | |
| Plasmid | |||
| pBLK-fabp10a-il34-sv40 | For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation | ||
| pBSK-il34 | For il34 probe preparation | ||
| Fish | |||
| Tg (mpeg1: GFP) | Label macrophages with GFP | ||
| Tg (fabp10a: DsRed) | Label liver cells with DsRed | ||
| Tg (fab10a:il34) | Over-expression IL-34 in liver cells |
References
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