Summary

نموذج تعبير كيميائي خارج الرحم لاختبار توظيف الضامة في فيفو

Published: September 25, 2019
doi:

Summary

لاختبار تأثير chemokine على تجنيد الضامة في الجسم الحي، تم استخدام جبل كامل في الموقع التهجين للكشف عن التعبير خارج الرحم من chemokine، واستخدمت تلطيخ المناعة لتسمية الضامة. تم استخدام التصوير الحي للمراقبة في الوقت الحقيقي لهجرة الضامة.

Abstract

وتستخدم على نطاق واسع حمار وحشي في البحوث الأساسية والطبية الحيوية. العديد من خطوط حمار وحشي المعدلة وراثيا متاحة حاليا لتسمية أنواع مختلفة من الخلايا. بسبب الجسم الجنيني الشفاف من سمك الحمار الوحشي ، فمن المناسب بالنسبة لنا لدراسة تأثير واحد chemokine على سلوك نوع معين من الخلايا في الجسم الحي. هنا قدمنا سير العمل للتحقيق في وظيفة chemokine على هجرة الضامة في الجسم الحي. قمنا ببناء بلازميد الإفراط في التعبير الأنسجة الخاصة لالإفراط في التعبير IL-34 وحقن بلازميد في مرحلة خلية واحدة أجنة الأسماك المعدلة وراثيا التي وصفت الضامة على وجه التحديد من قبل بروتين الفلورسنت. ثم استخدمنا جبل كامل الفلورسنت في الموقع التهجين والمناعية للكشف عن نمط التعبير chemokine وعدد أو موقع الضامة. تم رفع الأجنة WT حقن لتوليد خط مستقر المعدلة وراثيا. وأخيرا، استخدمنا التصوير الحي البؤري لمراقبة سلوك الضامة مباشرة في الأسماك المعدلة وراثيا مستقرة لدراسة وظيفة IL-34 على الضامة في الجسم الحي.

Introduction

سمك الحمار الوحشي هو صغير الاستوائية الصلبة العظام أسماك المياه العذبة نشأت في الهند. وفيما يتعلق بحفظ الجينات، حمار وحشي لديها تشابه من 87٪ إلى الإنسان1. يمكن أن توفر لنا رؤى حول المواضيع ذات الصلة من الإنسان من خلال دراسة تنظيم الجينات، وظيفة البروتين وسلوك الخلية مثل الهجرة، et.al الانتشار في حمار وحشي. يمكن استخدام جنين سمك الحمار الوحشي لمراقبة تطور الأجنة المبكرة في مراحل مختلفة بعد تثبيط الصباغ. وفي الوقت نفسه، فإنه يأخذ ثلاثة أشهر فقط لحمار وحشي لتطوير إلى النضج الجنسي، ثم حمار وحشي يمكن أن تنتج مئات من البيض كل 4 أيام. صغيرة الحجم، وتربية بسيطة، والقدرة الإنجابية القوية، وهذه المزايا تجعل ثقافة حمار وحشي جدا توفير الفضاء، مما يؤدي إلى ثقافة واسعة النطاق. الماوس نموذج الثدييات التقليدية لديها تكاليف صيانة أعلى من حمار وحشي، وبالتالي الحد من حجم رفع الماوس. في جانب نمو الجنين المبكر ، من الصعب ملاحظة جنين الفأر في حالة حية بسبب خصائص نمو جنين الفئران في رحم الأم. على العكس من ذلك، تتطور أجنة حمار وحشي خارجيا ً وتتسم بالشفافية، وبالتالي يسهل ملاحظتها تحت المجهر. وعلاوة على ذلك، من السهل جدا بناء مجموعة متنوعة من الخطوط المعدلة وراثيا للبحوث ذات الصلة وظيفة الجينات. حاليا، تتوفر خطوط مختلفة من أسماك الحمار الوحشي المعدلة وراثيا لتسمية أنواع مختلفة من الخلايا. فمن المريح جدا الآن لبناء خطوط المعدلة وراثيا لالإفراط في التعبير عن العلاج الكيميائي في مواقع محددة ودراسة وظيفة chemokines على سلوك الخلية في حمار وحشي.

هنا، قدمنا سير العمل لاستخدام حمار وحشي خط المعدلة وراثيا للتحقيق في وظيفة IL-34 على سلوك الضامة في الجسم الحي2،3،4،5،6،7. أولا، قمنا ببناء بلازميد الإفراط في التعبير عن الكبد محددة من الجينات il34 وحقن بلازميد في مرحلة خلية واحدة TG (mpeg1: GFP) أجنة الأسماك التي وصفت على وجه التحديد الضامة من قبل GFP البروتين الفلورسنت. ثم، استخدمنا جبل كامل الفلورسنت في الموقع التهجين وتلطيخ المناعة للكشف عن نمط التعبير il34 وعدد أو موقع الضامة. تم رفع الأجنة WT حقن لتوليد خط مستقر المعدلة وراثيا. في هذه الخطوات، أنشأنا والتحقق من صحة خط إنتاج السيتوكين وتقييم بصريا الآثار التي يمكن رؤيتها على توزيع الضامة. وأخيرا، للتحقيق في سلوك الضامة ردا على السيتوكين، استخدمنا التصوير الحي البؤري لمراقبة مباشرة هجرة الضامة لتأكيد وظيفة il34 على هجرة الضامة في الجسم الحي.

Protocol

ملاحظة: تم علاج جميع العينات بواسطة فينيلثيويوريا (PTU) ماء البيض لمنع الصباغ. 1. توليد TG (fabp10a: il34)المنشآت المعدلة وراثيا وحقن الأسماك استنساخ 2.8 كيلو بايت fabp10a المروج8 ومناطق الترميز IL-34 (ENSDART00000126460.3) من حمار وحشي في ناقلات pTol2 لتوليد بنا…

Representative Results

ويبين الشكل 2الخطوات التي ينطوي عليها بروتوكول سمك الحمار الوحشي. أولا، قمنا بإنشاء pBLK-fabp10a-il34-sv40 الذي كان يقودها il34 من قبل المروج fabp10a (الشكل 2). تم حقن البناء ميكروين في مرحلة خلية واحدة Tg (mpeg1: GFP)أجنة حمار وحشي التي يمكن ت…

Discussion

البروتوكول الموضح هنا يسمح لنا للتحقيق في وظيفة chemokine على سلوك الجسم الحي الضامة والإجراء يتطلب بعض الخبرة التقنية. وباختصار، هناك عدة خطوات حاسمة لتجنب المضاعفات في البروتوكول: 1) اختيار خط مناسب وراثيا الذي يظهر إشارة محددة وقوية المعدلة وراثيا لتسمية الخلية ذات الأهمية؛ (2) اختيار خط من?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر الدكتور جينغرونغ بنغ لتقاسم Tg (fabp10a: DsRed) خط المعدلة وراثيا; الدكتور زيلونغ ون لتقاسم TG (mpeg1: GFP) خطوط المعدلة وراثيا؛ د. كويتشي كاواكامي لتوفير متجه pTol2. وقد تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31771594)، ومشاريع خطة قوانغدونغ للعلوم والتكنولوجيا (2019A030317001) وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (D2191450).

Materials

Antibody
Alexa 488-Anti-Goat antibody Invitrogen A11055
Anti-Digoxigenin-HRP  perkinelmer NEF832001EA
Goat-Anti-GFP antibody Abcam ab6658
Reagent
CaCl2H2O Sigma 21097
Cyanine 3 Plus Amplification Reagent perkinelmer NEL745001KT
E2 solution 15 mM  NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 µM  KH2PO4 + 50 µM  Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3 
Fetal Bovine Serum(FBS) Life 10099-133
formamide Diamond A100314
glycerol  Sigma V900860
heparin sodium Sigma H3149
hybridization buffer(HB) 50% formamide+ 5×SSC+9 mM sodium citrate+50 μg/ml heparin sodium+ 500 μg/ml tRNA+ 0.1% Tween20
KCl Sigma P5405
KH2PO4 Sigma P5655
low melting agarose Sigma A9414
methanol GHTECH 1.17112.023
methylene blue  Sigma M9140
MgSO4 Sigma M2643
Na2HPO4 Sigma S5136
NaCl Sigma S5886
NaHCO3  Sigma S5761
paraformaldehyde(PFA) Sigma 158127 Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 °C  to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 °C. Caution. Manipulate with mask.
10×PBS 14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O
phenylthiourea(PTU) Sigma P7629
1×Plus Amplification Diluent perkinelmer NEL745001KT
Proteinase K  Fermentas E00492
20×Saline sodium citrate(SSC) 175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0
sodium citrate Sigma A5040
tricaine Sigma E10521
tRNA  Sigma R6625
Tween20 Sigma P2287
Plasmid
pBLK-fabp10a-il34-sv40 For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation
pBSK-il34 For il34 probe preparation
Fish
Tg (mpeg1: GFP) Label macrophages with GFP
Tg (fabp10a: DsRed) Label liver cells with DsRed
Tg (fab10a:il34) Over-expression IL-34 in liver cells

References

  1. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  2. Wang, Y., et al. IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia. Nature Immunology. 13 (8), 753-760 (2012).
  3. Lin, H., et al. Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome. Science. 320 (5877), 807-811 (2008).
  4. Wei, S., et al. Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloid cells. Journal of leukocyte biology. 88 (3), 495-505 (2010).
  5. Etienne, D., Foucher, S. B. L. P., Norbert Ifrah, P. G. Y. D. IL-34 Induces the Differentiation of Human Monocytes into Immunosuppressive Macrophages. Antagonistic Effects of GM-CSF and IFNc. PLoS One. 8 (2), e56045 (2013).
  6. Segaliny, A. I., et al. Syndecan-1 regulates the biological activities of interleukin-34. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (5), 1010-1021 (2015).
  7. Zhou, S. L., et al. miR-28-5p-IL-34-macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis. Hepatology. 63 (5), 1560-1575 (2016).
  8. Gordon, J. I., et al. Tissue specific expression and developmental regulation of two genes coding for rat fatty acid binding proteins. Journal of Biological Chemistry. 260 (4), 1995-1998 (1985).
  9. Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
  10. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: a practical approach. , (2002).
  11. Jiang, Y., Chen, J., Yen, K., Xu, J. Ectopically Expressed IL-34 Can Efficiently Induce Macrophage Migration to the Liver in Zebrafish. Zebrafish. 16 (2), 165-170 (2019).

Play Video

Cite This Article
Jiang, Y., Chen, J., Xu, J. An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo. J. Vis. Exp. (151), e60161, doi:10.3791/60161 (2019).

View Video