Vivo Makrofaj İşe Test için Bir Ektopik Kemokin İfade Modeli
Summary
Bir kemokinin in vivo makrofaj alımı üzerindeki etkisini test etmek için, yerinde hibridizasyondaki tüm montaj, kemokinin ektopik ekspresyonunu saptamak için kullanıldı ve makrofajları etiketlemek için immünboyama kullanıldı. Makrofaj göçünün gerçek zamanlı gözlemi için canlı görüntüleme kullanıldı.
Abstract
Zebra balıkları temel ve biyomedikal araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Birçok zebra balığı transgenik hatları şu anda hücrelerin çeşitli etiketlemek için kullanılabilir. Zebra balığının saydam embriyonik gövdesi sayesinde, bir kemokinin in vivo hücrelerinin belirli bir türünün davranışı üzerindeki etkisini incelemek bizim için uygundur. Burada in vivo makrofaj göçü üzerine bir kemokin işlevini araştırmak için bir iş akışı sağladı. IL-34’ü aşırı ekspresye etmek için dokuya özgü aşırı ekspresyon plazmidi yaptık ve plazmidi makrofajları özellikle floresan proteinle etiketlenmiş tek hücreli transgenik balık embriyolarına enjekte ettik. Daha sonra keokin ekspresyonu paterni ve makrofajların sayısını veya yerini saptamak için yerinde hibridizasyon ve immünboyama tüm montaj floresan kullanılır. Enjekte edilen WT embriyoları kararlı bir transgenik çizgi oluşturmak için yetiştirildi. Son olarak, in vivo makrofajlar üzerinde IL-34 işlevini incelemek için doğrudan kararlı transgenik balık makrofaj davranışı gözlemlemek için konfokal canlı görüntüleme kullanılır.
Introduction
Zebra balığı Hindistan kökenli küçük bir tropikal sert kemikli tatlı su balığıdır. Gen koruma ile ilgili olarak, zebra balıkları insan1%87 benzerlik var. Zebra balıklarında gen regülasyonu, protein fonksiyonu ve hücre davranışı, et.al gibi hücre davranışlarını inceleyerek bize insanla ilgili konular hakkında bilgi verebilir. Zebrabalığı embriyosu pigmentini inhibe ettikten sonra farklı evrelerde erken embriyoların gelişimini gözlemlemek için kullanılabilir. Bu arada, zebra balıklarının cinsel olgunluğa dönüşmesi sadece üç ay sürer, o zaman zebra balığı her 4 günde bir yüzlerce yumurta üretebilir. Mini boyutlu, basit üreme, güçlü üreme kapasitesi, bu avantajlar zebra balığı kültürünü çok yer tasarrufu sağlar, büyük ölçekli kültüre elverişli dir. Geleneksel memeli model fare zebra balığıdaha yüksek bakım maliyetleri vardır, bu nedenle fare yetiştirme ölçeğini sınırlayan. Erken embriyo gelişimi açısından, fare embriyosu anne rahminde fare embriyo gelişiminin özellikleri nedeniyle canlı durumda gözlemlemek zordur. Aksine, zebra balığı embriyoları dışarıdan gelişir ve saydamdır, bu nedenle mikroskop altında gözlemlemek kolaydır. Ayrıca, zebra balığı ilgili gen fonksiyonu araştırma için transgenik çizgiler çeşitli inşa etmek çok kolaydır. Şu anda, çeşitli zebra balığı transgenik hatları hücrelerin farklı etiket mevcuttur. Kemokinleri belirli yerlerde aşırı eksprese etmek ve keokinlerin zebra balıklarındaki hücre davranışı üzerine çalışmasını incelemek için transgenik çizgiler oluşturmak artık çok uygundur.
Burada, il-34’ün in vivo2,3,4,5,6,7makrofaj davranışı üzerindeki işlevini araştırmak için zebra balığı transgenik hattını kullanmak için bir iş akışı sağladık. İlk olarak, il34 geninin karaciğere özgü aşırı ekspresyon plazmidini inşa ettik ve plazmidi tek hücreli evre Tg’ye (mpeg1: GFP) enjekte ettik ve bu da makrofajları özellikle floresan protein GFP ile etiketledi. Daha sonra, il34 ekspresyonunun desenini ve makrofajların sayısını veya yerini tespit etmek için yerinde hibridizasyon ve immünboyamada tüm montaj floresanını kullandık. Enjekte edilen WT embriyoları kararlı bir transgenik çizgi oluşturmak için yetiştirildi. Bu adımlarda sitokin üreten çizgiyi oluşturduk ve doğruladık ve makrofaj dağılımında görülebilecek etkileri görsel olarak değerlendirdik. Son olarak, sitokine yanıt olarak makrofaj davranışını araştırmak için, in vivo makrofaj göçünde il34’ün işlevini doğrulamak için makrofaj göçüne doğrudan gözlemlemek için konfokal canlı görüntüleme kullandık.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokol bize makrofajin vivo davranışı üzerinde bir kemokin işlevini araştırmak için izin verir ve prosedür bazı teknik uzmanlık gerektirir. Özetle, protokoldeki komplikasyonları önlemek için birkaç kritik adım vardır: 1) ilgi hücresini etiketlemek için spesifik ve güçlü transgenik sinyal gösteren uygun bir transgenik çizgi seçin; 2) görüntüleme ve transgenik gen aşırı ekspresyonu için erişilebilir uygun bir doku seçin; 3) hassas ve spesifik bir RNA probu yapmak; 4) …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Jingrong Peng’e Tg (fabp10a: DsRed) transgenik hattını paylaştığı için teşekkür ederiz; Dr Zilong Wen Tg (mpeg1: GFP) transgenik hatları paylaşmak için; Dr. Koichi Kawakami pTol2 vektörü sağladığı için. Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31771594), Guangdong Bilim ve Teknoloji Planı projeleri (2019A030317001) ve Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları (D2191450) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Antibody | |||
| Alexa 488-Anti-Goat antibody | Invitrogen | A11055 | |
| Anti-Digoxigenin-HRP | perkinelmer | NEF832001EA | |
| Goat-Anti-GFP antibody | Abcam | ab6658 | |
| Reagent | |||
| CaCl2· 2H2O | Sigma | 21097 | |
| Cyanine 3 Plus Amplification Reagent | perkinelmer | NEL745001KT | |
| E2 solution | 15 mM NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 µM KH2PO4 + 50 µM Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3 | ||
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Life | 10099-133 | |
| formamide | Diamond | A100314 | |
| glycerol | Sigma | V900860 | |
| heparin sodium | Sigma | H3149 | |
| hybridization buffer(HB) | 50% formamide+ 5×SSC+9 mM sodium citrate+50 μg/ml heparin sodium+ 500 μg/ml tRNA+ 0.1% Tween20 | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| low melting agarose | Sigma | A9414 | |
| methanol | GHTECH | 1.17112.023 | |
| methylene blue | Sigma | M9140 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| paraformaldehyde(PFA) | Sigma | 158127 | Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 °C to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 °C. Caution. Manipulate with mask. |
| 10×PBS | 14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O | ||
| phenylthiourea(PTU) | Sigma | P7629 | |
| 1×Plus Amplification Diluent | perkinelmer | NEL745001KT | |
| Proteinase K | Fermentas | E00492 | |
| 20×Saline sodium citrate(SSC) | 175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0 | ||
| sodium citrate | Sigma | A5040 | |
| tricaine | Sigma | E10521 | |
| tRNA | Sigma | R6625 | |
| Tween20 | Sigma | P2287 | |
| Plasmid | |||
| pBLK-fabp10a-il34-sv40 | For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation | ||
| pBSK-il34 | For il34 probe preparation | ||
| Fish | |||
| Tg (mpeg1: GFP) | Label macrophages with GFP | ||
| Tg (fabp10a: DsRed) | Label liver cells with DsRed | ||
| Tg (fab10a:il34) | Over-expression IL-34 in liver cells |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wang, Y., et al. IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia. Nature Immunology. 13 (8), 753-760 (2012).
- Lin, H., et al. Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome. Science. 320 (5877), 807-811 (2008).
- Wei, S., et al. Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloid cells. Journal of leukocyte biology. 88 (3), 495-505 (2010).
- Etienne, D., Foucher, S. B. L. P., Norbert Ifrah, P. G. Y. D. IL-34 Induces the Differentiation of Human Monocytes into Immunosuppressive Macrophages. Antagonistic Effects of GM-CSF and IFNc. PLoS One. 8 (2), e56045 (2013).
- Segaliny, A. I., et al. Syndecan-1 regulates the biological activities of interleukin-34. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (5), 1010-1021 (2015).
- Zhou, S. L., et al. miR-28-5p-IL-34-macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis. Hepatology. 63 (5), 1560-1575 (2016).
- Gordon, J. I., et al. Tissue specific expression and developmental regulation of two genes coding for rat fatty acid binding proteins. Journal of Biological Chemistry. 260 (4), 1995-1998 (1985).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: a practical approach. , (2002).
- Jiang, Y., Chen, J., Yen, K., Xu, J. Ectopically Expressed IL-34 Can Efficiently Induce Macrophage Migration to the Liver in Zebrafish. Zebrafish. 16 (2), 165-170 (2019).
