Эктопическая модель экспрессии хемокина для тестирования макрофагов набора в Vivo
Summary
Чтобы проверить влияние хемокина на набор макрофагов in vivo, для обнаружения эктопического выражения хемокина использовалась вся монтация на макрофаг. Для наблюдения макрофагов в режиме реального времени использовалась живая визуализация.
Abstract
Зебрафиш широко используется в фундаментальных и биомедицинских исследованиях. Многие трансгенные линии зебры в настоящее время доступны для обозначения различных типов клеток. Благодаря прозрачному эмбриональному телу зебры, нам удобно изучать влияние одного хемокина на поведение определенного типа клеток in vivo. Здесь мы предоставили рабочий процесс для изучения функции хемокина по миграции макрофагов in vivo. Мы построили ткани конкретных переэкспрессии плазмид для переэкспресса IL-34 и вводили плазмид в одной-клеточной стадии трансгенных эмбрионов рыб, макрофаги которых были специально помечены флуоресцентным белком. Затем мы использовали целые флуоресцентные установки на месте гибридизации и иммуно-стинеризм для обнаружения картины экспрессии хемокина и количество или расположение макрофагов. Инъекционные эмбрионы WT были подняты для создания стабильной трансгенной линии. Наконец, мы использовали конфокальные живые изображения, чтобы непосредственно наблюдать за поведением макрофагов в стабильных трансгенных рыб для изучения функции IL-34 на макрофагах in vivo.
Introduction
Зебрафиш — небольшая тропическая пресноводная рыба, зародившаяся в Индии. Что касается сохранения генов, зебрафиш имеют сходство 87% с человеком1. Он может дать нам представление о смежных предметах человека, изучая регуляцию генов, функцию белка и поведение клеток, такие как миграция, пролиферация et.al у зебры. Эмбрион зебры может быть использован для наблюдения за развитием ранних эмбрионов на разных стадиях после ингибирования пигмента. Между тем, это занимает всего три месяца для зебры развиваться в половой зрелости, то зебрафиш может производить сотни яиц каждые 4 дня. Мини-размер, простое разведение, сильная репродуктивная способность, эти преимущества делают культуру зебры очень экономной, способствующей крупномасштабной культуре. Традиционная модель мыши млекопитающих имеет более высокие расходы на техническое обслуживание, чем зебрафиш, таким образом, ограничивая масштабы поднятия мыши. В аспекте раннего развития эмбриона, эмбрион мыши трудно наблюдать в живом состоянии из-за характеристик развития эмбриона мыши в утробе матери. Напротив, эмбрионы зебры развиваются внешне и прозрачны, поэтому их легко наблюдать под микроскопом. Кроме того, зебрафиш очень легко построить различные трансгенные линии для связанных исследований функции генов. В настоящее время, различные трансгенные линии зебры доступны для обозначения различных типов клеток. Это очень удобно сейчас, чтобы построить трансгенные линии для переэкспресса хемокинов в конкретных местах и изучить функции хемокинов на поведение клеток у зебры.
Здесь мы предоставили рабочий процесс для использования трансгенной линии зебры для исследования функции IL-34 на поведение макрофагов in vivo2,3,4,5,6,7. Во-первых, мы построили печени конкретных переэкспрессии плазмид гена il34 и вводили плазмид в одноклеточной стадии Tg (mpeg1: GFP) рыбных эмбрионов, которые специально помечены макрофагов флуоресцентным белком GFP. Затем мы использовали целые флуоресцентные установки на месте гибридизации и иммуно-стинеризм для обнаружения картины экспрессии il34 и числа или расположения макрофагов. Инъекционные эмбрионы WT были подняты для создания стабильной трансгенной линии. В этих шагах мы установили и проверили линию производства цитокинов и визуально оценили эффекты, которые можно увидеть на распределении макрофагов. Наконец, для изучения поведения макрофагов в ответ на цитокин, мы использовали конфокальные живые изображения, чтобы непосредственно наблюдать миграцию макрофагов, чтобы подтвердить функцию il34 на миграции макрофагов in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный здесь протокол позволяет исследовать функцию хемокина о поведении макрофагеина vivo и процедура требует некоторых технических знаний. Таким образом, существует несколько важных шагов, чтобы избежать осложнений в протоколе: 1) выбрать подходящую трансгенную линию, которая пок?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-ра Jingrong Пэн для обмена Tg (fabp10a: DsRed) трансгенной линии; Д-р Зилонг Вэнь для обмена Tg (mpeg1: GFP) трансгенных линий; Д-р Коити Каваками за предоставление вектора pTol2. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (31771594), проектами научно-технического плана Гуандун (2019A030317001) и Фондами фундаментальных исследований для центральных университетов (D2191450).
Materials
| Antibody | |||
| Alexa 488-Anti-Goat antibody | Invitrogen | A11055 | |
| Anti-Digoxigenin-HRP | perkinelmer | NEF832001EA | |
| Goat-Anti-GFP antibody | Abcam | ab6658 | |
| Reagent | |||
| CaCl2· 2H2O | Sigma | 21097 | |
| Cyanine 3 Plus Amplification Reagent | perkinelmer | NEL745001KT | |
| E2 solution | 15 mM NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 µM KH2PO4 + 50 µM Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3 | ||
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Life | 10099-133 | |
| formamide | Diamond | A100314 | |
| glycerol | Sigma | V900860 | |
| heparin sodium | Sigma | H3149 | |
| hybridization buffer(HB) | 50% formamide+ 5×SSC+9 mM sodium citrate+50 μg/ml heparin sodium+ 500 μg/ml tRNA+ 0.1% Tween20 | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| low melting agarose | Sigma | A9414 | |
| methanol | GHTECH | 1.17112.023 | |
| methylene blue | Sigma | M9140 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| paraformaldehyde(PFA) | Sigma | 158127 | Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 °C to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 °C. Caution. Manipulate with mask. |
| 10×PBS | 14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O | ||
| phenylthiourea(PTU) | Sigma | P7629 | |
| 1×Plus Amplification Diluent | perkinelmer | NEL745001KT | |
| Proteinase K | Fermentas | E00492 | |
| 20×Saline sodium citrate(SSC) | 175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0 | ||
| sodium citrate | Sigma | A5040 | |
| tricaine | Sigma | E10521 | |
| tRNA | Sigma | R6625 | |
| Tween20 | Sigma | P2287 | |
| Plasmid | |||
| pBLK-fabp10a-il34-sv40 | For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation | ||
| pBSK-il34 | For il34 probe preparation | ||
| Fish | |||
| Tg (mpeg1: GFP) | Label macrophages with GFP | ||
| Tg (fabp10a: DsRed) | Label liver cells with DsRed | ||
| Tg (fab10a:il34) | Over-expression IL-34 in liver cells |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wang, Y., et al. IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia. Nature Immunology. 13 (8), 753-760 (2012).
- Lin, H., et al. Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome. Science. 320 (5877), 807-811 (2008).
- Wei, S., et al. Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloid cells. Journal of leukocyte biology. 88 (3), 495-505 (2010).
- Etienne, D., Foucher, S. B. L. P., Norbert Ifrah, P. G. Y. D. IL-34 Induces the Differentiation of Human Monocytes into Immunosuppressive Macrophages. Antagonistic Effects of GM-CSF and IFNc. PLoS One. 8 (2), e56045 (2013).
- Segaliny, A. I., et al. Syndecan-1 regulates the biological activities of interleukin-34. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (5), 1010-1021 (2015).
- Zhou, S. L., et al. miR-28-5p-IL-34-macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis. Hepatology. 63 (5), 1560-1575 (2016).
- Gordon, J. I., et al. Tissue specific expression and developmental regulation of two genes coding for rat fatty acid binding proteins. Journal of Biological Chemistry. 260 (4), 1995-1998 (1985).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: a practical approach. , (2002).
- Jiang, Y., Chen, J., Yen, K., Xu, J. Ectopically Expressed IL-34 Can Efficiently Induce Macrophage Migration to the Liver in Zebrafish. Zebrafish. 16 (2), 165-170 (2019).
