Caracterización de agregados de proteínas individuales por nanoespectroscopia infrarroja y microscopía de fuerza atómica

Más de 40 millones de personas en todo el mundo se ven afectadas actualmente por trastornos neurodegenerativos, como el Alzheimer (AD)¹ y las enfermedades de Parkinson (PD)^2. En términos más generales, más de cincuenta patologías se asocian a nivel molecular con el desdoblamiento y la agregación de proteínas, un proceso que conduce a la proliferación de agregados de proteínas fibrilares insolubles, conocidos como depósitos amiloide^{3, 4}. Los orígenes moleculares de la neurodegeneración y sus vínculos con los cambios conformacionales proteicos de las proteínas que conducen a la formación de amiloide, sin embargo, siguen sin estar claros, en gran parte debido al alto nivel de heterogeneidad, naturaleza transitoria y nanoescala dimensiones de los agregados patológicos^4,5.

Investigaciones de gran éxito de las estructuras proteicas en las últimas décadas se han basado ampliamente en el uso de métodos a granel, incluyendo cristalografía de rayos X, microscopía crioelectrónica y espectroscopia de resonancia magnética nuclear^{5, 6 , 7 , 8 , 9}. Dentro de esta clase de técnicas, la espectroscopia infrarroja (IR) ha surgido como una herramienta analítica sensible para desentrañar las propiedades químicas de sistemas biológicos como las proteínas^8. Los métodos IR permiten cuantificar los cambios estructurales secundarios y cuaternarios de proteínas durante su desdoblamiento y agregación. Además, con el fin de descifrar aún más a nivel microscópico los detalles mecanicistas involucrados en los complejos paisajes de energía libre de proteínas durante su agregación, un avance importante ha sido el desarrollo de herramientas químicas cinéticas para extender a caminos de autoensamblaje incluyendo la formación de fibrillas amiloideas^{5,6,7,10,11,12}. Sin embargo, los métodos espectroscópicos a granel proporcionan sólo información media sobre el conjunto heterogéneo de especies presentes en la solución o involucradas en pasos microscópicos específicos, lo que hace que la investigación de las propiedades biofísicas de especies agregadas desafiantes en el nivel de nanoescala^13,14.

Varias técnicas de microscopía con la capacidad de operar en escalas más pequeñas que el límite de difracción de luz han surgido en las últimas décadas. Esta clase de métodos incluye microscopía electrónica (EM) y microscopía de fuerza atómica (AFM). Mientras que la microscopía electrónica de barrido (SEM) y la microscopía electrónica de transmisión (TEM) proporcionan imágenes bidimensionales (2D) de una muestra, AFM ha surgido en las últimas décadas como una técnica poderosa y versátil para estudiar morfologías tridimensionales (3D), como morfologías tridimensionales (3D), como así como las propiedades nanomecánicas de una muestra con resolución subnanómetro^{13,14,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27}. La razón de ser del estudio de la agregación de proteínas a través de AFM es que este enfoque permite la investigación de la morfología de las especies individuales presentes en la solución^{13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37}. En particular, mediante el seguimiento de la muestra en función del tiempo, AFM permite la investigación de la evolución de la morfología de la especie dentro de la muestra, lo que permite seguir y visualizar las vías de formación de amiloide^{23, 25,38,39,40,41,42}. Además, AFM permite la cuantificación de parámetros estructurales como las alturas transversales y longitudes de las especies individuales presentes en la solución^{13,19,30,31 ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44 , 45 , 46 , 47 , 48}. Sin embargo, el estudio de una sola propiedad biofísica, como la morfología, a menudo no es suficiente cuando se estudian sistemas biológicos heterogéneos y complejos. Los métodos de imágenes AFM, SEM o TEM por sí solos no revelan fácilmente las propiedades químicas de las especies heterogéneas de agregados amiloide a nanoescala.

Recientemente se ha realizado un importante avance para el análisis de muestras biológicas heterogéneas a esta escala con el desarrollo y la aplicación en el campo de la agregación proteica de la nanoespectroscopia infrarroja (AFM-IR)^{24,26, 38,42,49,50,51,52}. Este innovador método aprovecha la combinación de la resolución espacial de AFM (1 x 10 nm) con el poder de análisis químico de IR. La técnica AFM-IR se basa en la medición del efecto de resonancia inducida fototérmica impulsada por un láser IR, y en la medición de la expansión térmica de la muestra bajo investigación por la punta del AFM. La muestra puede ser iluminada por el láser IR directamente desde la parte superior o desde la parte inferior en la reflexión interna total, de forma similar a la de la espectroscopia infrarroja convencional^24,42,52,53 . El láser IR se puede pulsada con frecuencias típicas en el orden de cientos de kilohercios (1-1000 kHz) y sintonizado en un amplio rango espectral, típicamente entre 1000-3300 cm^-1. Aunque la fuente láser cubre un área de 30 m de diámetro, la resolución espacial de la técnica AFM-IR está determinada nominalmente por el diámetro de la punta AFM, que detecta la expansión térmica local del sistema. AFM-IR es muy adecuado para estudiar muestras biológicas porque la señal IR es proporcional a su espesor de hasta 1 x 1,5 m, y los espectros IR resultantes son generalmente de acuerdo con los espectros de transmisión FTIR correspondientes^{13,54 ,55}. Por esta razón, los métodos establecidos de análisis en espectroscopia se pueden aplicar fácilmente, como el estudio de los cambios químicos, el cambio de forma de la banda y la desconvolución mediante el análisis de derivados segundo⁵². En general, combinando la resolución espacial de AFM con el poder de reconocimiento químico de la espectroscopia IR, AFM-IR permite la adquisición simultánea de una amplia gama de propiedades morfológicas, mecánicas y químicas de una muestra a nanoescala.

Aquí, ilustramos un protocolo para la caracterización del proceso de agregación de proteínas que explota la combinación de ensayos de fluorescencia in vitro, imágenes AFM de alta resolución y AFM-IR a nanoescala. Este enfoque combinado ya ha sobresalido en proporcionar resultados detallados en el estudio de las propiedades químicas y estructurales de las microgotas individuales formadas por agregados proteicos, en el estudio de la separación de fase sin proteínas líquidas y líquidas, y en investigando la heterogeneidad y las propiedades biofísicas de las especies agregadas individuales a la nanoescala^{23,26,38,45,50,53, 56,57}.