Caratterizzazione degli aggregati proteici individuali mediante nanospettroscopia a infrarossi e microscopia a forza atomica

Oltre 40 milioni di persone in tutto il mondo sono attualmente colpite da disturbi neurodegenerativi, come il morbo di Alzheimer (AD)¹ e le malattie di Parkinson (PD)^2. Più in generale, più di cinquanta patologie sono associate a livello molecolare a misfolding e aggregazione delle proteine, un processo che porta alla proliferazione di aggregati di proteine fibrillari insolubili, noti come depositi di amiloide^{3, 4.}Le origini molecolari della neurodegenerazione e i suoi legami con i cambiamenti conformazionali proteici delle proteine che portano alla formazione di amiloidi, tuttavia, rimangono poco chiare, in gran parte a causa dell’alto livello di eterogeneità, natura transitoria e su scala nanometrica dimensioni degli aggregati patologici^4,5.

Indagini di grande successo sulle strutture proteiche negli ultimi decenni si sono basate ampiamente sull’uso di metodi sfusi, tra cui la cristallografia a raggi X, la microscopia crioelettronica e la spettroscopia a risonanza magnetica nucleare^5, 6 È ^{possibile: , 7 (in} questo stato ^, 8 (IN ^{vio , 9}. All’interno di questa classe di tecniche, la spettroscopia a infrarossi (IR) è emersa come uno strumento analitico sensibile per svelare le proprietà chimiche dei sistemi biologici come le proteine⁸. I metodi di iR consentono la quantificazione delle variazioni strutturali secondarie e quaternarie durante il loro misfolding e aggregazione. Inoltre, al fine di decifrare ulteriormente a livello microscopico i dettagli meccanicistici coinvolti nei complessi paesaggi di energia libera delle proteine durante la loro aggregazione, un importante progresso è stato lo sviluppo di strumenti di cinetica chimica per estendere a complessi percorsi di auto-assemblaggio tra cui amiloide fibrille formazione^{5,6,7,10,11,12}. Tuttavia, i metodi spettroscopici di massa forniscono solo informazioni medie sull’insieme eterogeneo di specie presenti nella soluzione o coinvolte in specifici passaggi microscopici, rendendo così lo studio delle proprietà biofisiche dei singoli specie aggregate impegnative al livello su nanoscala^13,14.

Diverse tecniche di microscopia con la capacità di operare su scale più piccole del limite di diffrazione della luce sono emerse negli ultimi decenni. Questa classe di metodi include la microscopia elettronica (EM) e la microscopia a forza atomica (AFM). Mentre la microscopia elettronica a scansione (SEM) e la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) forniscono immagini bidimensionali (2D) di un campione, l’AFM è emersa negli ultimi decenni come una tecnica potente e versatile per studiare morfologie tridimensionali (3D), come così come le proprietà nanomeccaniche di un campione con risoluzione sub-nanometrica^{13,14,15,16,17,18,19, 20 anni , 21 Mieto , 22 Milia , 23} del 23 o ^{, 24} Mi lasa’ di ^{, 25 mi lato , 26} del sistema di ^{, 27.}La logica alla base dello studio dell’aggregazione proteica tramite AFM è che questo approccio consente di studiare la morfologia delle singole specie presenti nella soluzione^{13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37}. In particolare, monitorando il campione in funzione del tempo, AFM consente di sforare l’evoluzione della morfologia della specie all’interno del campione, che permette di seguire e visualizzare i percorsi di formazione di amiloidi^{23, 25,38,39,40,41,42}. Inoltre, AFM consente la quantificazione dei parametri strutturali come le altezze e le lunghezze trasversali delle singole specie presenti nella soluzione^{13,19,30,31 ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44 (di sistema) , 45 anni , 46} per quanto ^{, 47 o , 48}. Tuttavia, lo studio di una singola proprietà biofisica, come la morfologia, spesso non è sufficiente quando si studiano sistemi biologici eterogenei e complessi. I metodi di imaging AFM, SEM o TEM da soli non rivelano facilmente le proprietà chimiche delle specie eterogenee di aggregati amiloidi su scala nanometrica.

Un importante progresso per l’analisi di campioni biologici eterogenei di questa portata è stato recentemente fatto con lo sviluppo e l’applicazione al campo dell’aggregazione proteica della nanospettroscopia infrarossa (AFM-IR)^{24,26, 38,42,49,50,51,52}. Questo metodo innovativo sfrutta la combinazione della risoluzione spaziale dell’AFM (1-10 nm) con il potere di analisi chimica di IR. La tecnica AFM-IR si basa sulla misurazione dell’effetto di risonanza indotta fototermica guidato da un laser AIR e sulla misurazione dell’espansione termica del campione in esame da parte della punta AFM. Il campione può essere illuminato dal laser a infrarossi direttamente dall’alto o dal basso nella riflessione interna totale, come nella spettroscopia a infrarossi convenzionale^24,42,52,53 . Il laser a raggi IR può essere pulsato con frequenze tipiche nell’ordine di centinaia di kilohertz (1,1000 kHz) e sintonizzato su un’ampia gamma spettrale, in genere tra i 1000-3300 cm^-1. Anche se la sorgente laser copre un’area di 30 m di diametro, la risoluzione spaziale della tecnica AFM-IR è determinata nominalmente dal diametro della punta AFM, che rileva l’espansione termica locale del sistema. AFM-IR è adatto per studiare campioni biologici perché il segnale IR è proporzionale al loro spessore fino a 1,5 m, e gli spettri IR risultanti sono generalmente in accordo con i corrispondenti spettri di trasmissione FTIR^{13,54 ,55}. Per questo motivo, i metodi stabiliti di analisi in spettroscopia possono essere facilmente applicati, come lo studio dei cambiamenti chimici, il cambiamento della forma della banda e la de-convoluzione mediante l’analisi dei secondi derivati⁵². Nel complesso, combinando la risoluzione spaziale dell’AFM con il potere di riconoscimento chimico della spettroscopia IR, AFM-IR consente l’acquisizione simultanea di un’ampia gamma di proprietà morfologiche, meccaniche e chimiche di un campione su scala nanometrica.

Qui, illustriamo un protocollo per la caratterizzazione del processo di aggregazione proteica che sfrutta la combinazione di saggi di fluorescenza in vitro, imaging AFM ad alta risoluzione e AFM-IR su nanometrica. Questo approccio combinato ha già eccellere nel fornire risultati dettagliati nello studio delle proprietà chimiche e strutturali delle singole micro-goccioline formate da aggregati proteici, nello studio della separazione di fase delle proteine liquide liquide e in studiare l’eterogeneità e le proprietà biofisiche delle singole specie aggregate su nanoscala^{23,26,38,45,50,53, 56,57}.