Характеристика индивидуальных белковых агрегатов с помощью инфракрасной наноспектроскопии и микроскопии атомной силы

Более 40 миллионов человек во всем мире в настоящее время страдают от нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера (AD)¹ и Паркинсона (PD)² заболеваний. В более общем плане, более пятидесяти патологий связаны на молекулярном уровне с протеином misfolding и агрегации, процесс, который приводит к распространению нерастворимых фибриллярных белковых агрегатов, известных как амилоидные отложения^{3, 4}. Молекулярное происхождение нейродегенерации и ее связи с белковыми конформанформашническими изменениями белков, приводящими к образованию амилоидов, однако, остаются неясными, в значительной степени из-за высокого уровня неоднородности, преходящей природы и наномасштаба размеры патологических агрегатов^4,5.

Высоко успешные исследования белковых структур в последние несколько десятилетий были широко основаны на использовании массовых методов, включая рентгеновскую кристаллографию, криоэлектронную микроскопию и ядерную магнитно-резонансную спектроскопию^{5, 6 , 7 (г. , 8 , 9}. В рамках этого класса методов, инфракрасная (ИК) спектроскопия стала чувствительным аналитическим инструментом, чтобы разгадать химические свойства биологических систем, таких как белки⁸. Методы ИК позволяют количественно освящать вторичные и четырехнорные структурные изменения во время их неправильного сворачивания и агрегации. Кроме того, для дальнейшей расшифровки на микроскопическом уровне механистических деталей, участвующих в сложных ландшафтах свободной энергии белка во время их агрегации, важным достижением стала разработка инструментов химической кинетики, которые будут распространяться на сложные самосборки пути, включая амилоидные фибрилиды формирования^{5,6,7,10,11,12}. Однако массовые спектроскопические методы обеспечивают только среднюю информацию о неоднородном ансамбле видов, присутствующих в растворе или участвующих в конкретных микроскопических шагах, тем самым делая исследование биофизических свойств человека агрегированные виды, бросающие вызов на наноуровне^13,14.

За последние десятилетия появилось несколько методов микроскопии, способных работать на масштабах меньше, чем предел дифракции света. Этот класс методов включает электронную микроскопию (EM) и атомную силовую микроскопию (AFM). В то время как сканирование электронной микроскопии (SEM) и трансмиссионная электронная микроскопия (TEM) обеспечивают двумерные (2D) изображения образца, AFM появился в последние десятилетия как мощный и универсальный метод для изучения трехмерных (3D) морфологий, как а также наномеханические свойства образца с субнанометровымразрешением^{13,14,15,16,18,19, 20 , 21 год , 22 Г. , 23 , 24 , 25 , 26 , 27}. Обоснование изучения агрегации белка через AFM является то, что этот подход позволяет исследования морфологии отдельных видов, присутствующих в решении^{13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37}. В частности, путем мониторинга образца в качестве функции времени, AFM позволяет иссмотреть эволюцию морфологии видов в образце, что позволяет следить и визуализировать пути формирования амилоидов^{23, 25,38,39,40,41,42}. Кроме того, AFM позволяет количественно определить структурные параметры, такие как поперечные высоты и длины отдельных видов, присутствующих в растворе^{13,19,30,31 ,32,33,}34^{,35,36,37,40,43, 44 , 45 г. , 46 , 47 год , 48}. Однако, изучение одного биофизического свойства, такого как морфология, часто недостаточно при изучении неоднородных и сложных биологических систем. AFM, SEM или TEM методы визуализации сами по себе не легко выявить химические свойства неоднородных видов амилоидных агрегатов на наноуровне.

Основной прогресс в анализе неоднородных биологических образцов такого масштаба был сделан недавно с развитием и применением в области агрегации белка инфракрасной наноспектроскопии (AFM-IR)^{24,26, 38,42,49,50,51,52}. Этот инновационный метод использует сочетание пространственного разрешения AFM (1–10 нм) с химическим анализом ИК. Техника AFM-IR основана на измерении фототермального индуцированного резонансного эффекта, управляемого ИК-лазером, и на измерении теплового расширения образца, исследуемого по наконечнику AFM. Образец может быть освещен ИК-лазером непосредственно сверху или снизу в общем внутреннем отражении, так же, как и в обычной инфракрасной спектроскопии^24,42,52,53 . ИК-лазер может пульсировать с типичными частотами в порядке сотен килогерц (1-1000 кГц) и настроен на широкий спектральный диапазон, как правило, между 1000-3300 см^-1. Хотя лазерный источник охватывает область диаметром 30 мкм, пространственное разрешение метода AFM-IR номинально определяется диаметром наконечника AFM, который обнаруживает локальное тепловое расширение системы. AFM-IR хорошо подходит для изучения биологических образцов, потому что ИК-сигнал пропорционален их толщине до 1,1,5 мкм, и полученные спектры ИК, как правило, в согласии с соответствующими спектрами передачи FTIR^{13,54 ,55}. По этой причине, установленные методы анализа в спектроскопии могут быть легко применены, такие как изучение химических сдвигов, изменение формы полосы и де-свертывания второй анализ производных⁵². В целом, сочетая пространственное разрешение AFM с химической силой распознавания ИК-спектроскопии, AFM-IR позволяет одновременно приобрести широкий спектр морфологических, механических и химических свойств образца на наноуровне.

Здесь мы иллюстрируем протокол для характеристики процесса агрегации белка, который использует сочетание in vitro флуоресценции анализы, с высоким разрешением AFM изображений и наномасштабных AFM-ИК. Этот комбинированный подход уже преуспел в предоставлении подробных результатов в изучении химических и структурных свойств отдельных микрокапель, образованных белковыми агрегатами, в изучении разделения фаз жидко-жидкого белка, а также в изучение неоднородности и биофизических свойств отдельных агрегированных видов на наномасштабе^{23,26,38,45,50,53, 56,57}.