وصف مجاميع البروتين الفردية عن طريق الفحص النانوي بالأشعة تحت الحمراء والفحص المجهري للقوة الذرية

أكثر من 40 مليون شخص في جميع أنحاء العالم يتأثرون حاليا بالاضطرابات العصبية، مثل مرض الزهايمر (AD)¹ ومرض باركنسون (PD)² الأمراض. وبشكل أعم، يرتبط أكثر من خمسين علم أمراض على المستوى الجزيئي مع سوء طي البروتين والتجميع، وهي عملية تؤدي إلى انتشار مجاميع بروتين الفيبريلار غير القابلة للذوبان، والمعروفة باسم رواسب الأميلويد^{3، 4.}الأصول الجزيئية للتنكس العصبي وصلاتها مع التغيرات المطابقة البروتينية للبروتينات مما يؤدي إلى تشكيل الأميلويد، ومع ذلك، لا تزال غير واضحة، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى مستوى عال من التغاير، والطبيعة العابرة ونانوscale أبعاد المجاميع المرضية^4،5.

وقد استندت التحقيقات الناجحة للغاية من هياكل البروتين في العقود القليلة الماضية على نطاق واسع على استخدام أساليب السائبة، بما في ذلك الأشعة السينية البلورات، والفحص المجهري الإلكترون بالتبريد ومطياف الرنين المغناطيسي النووي^{5، 6 , 7 , 8 , 9}. ضمن هذه الفئة من التقنيات، ظهرت الأشعة تحت الحمراء (IR) مطياف كأداة تحليلية حساسة لكشف الخصائص الكيميائية للنظم البيولوجية مثل البروتينات⁸. تسمح أساليب الأشعة تحت الحمراء بالقياس الكمي للتغيرات الهيكلية الثانوية والرباعية للبروتين أثناء طيها وتجميعها. وبالإضافة إلى ذلك، من أجل المزيد من فك على المستوى المجهري التفاصيل الميكانيكية التي تنطوي عليها المناظر الطبيعية المعقدة للطاقة الحرة من البروتين أثناء تجميعها، كان تقدما كبيرا في تطوير أدوات الحركية الكيميائية لتمتد إلى معقدة مسارات التجميع الذاتي بما في ذلك تشكيل الفيبريلات الأميلويد^{5،6،7،10،11،12.} ومع ذلك، فإن الأساليب الطيفية السائبة لا توفر سوى معلومات متوسطة عن مجموعة غير متجانسة من الأنواع الموجودة في الحل أو المشاركة في خطوات مجهرية محددة، مما يجعل التحقيق في الخصائص البيوفيزيائية للفرد الأنواع المجمعة التي تتحدى على مستوى النانو^13،14.

وقد ظهرت في العقود الأخيرة عدة تقنيات للتنظير المجهري مع القدرة على العمل على مقاييس أصغر من حد الانعراج للضوء. وتشمل هذه الفئة من الأساليب الفحص المجهري الإلكتروني (EM) والفحص المجهري للقوة الذرية (AFM). في حين أن المسح المجهري الإلكتروني (SEM) والفحص المجهري الإلكتروني للإرسال (TEM) يوفران صورًا ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) للعينة، فقد ظهر AFM في العقود الأخيرة كتقنية قوية ومتعددة الاستخدامات لدراسة المورفولوجيا ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد)، كما فضلا عن الخصائص النانوية الميكانيكا للعينة مع قرار دون نانومتر^{13،14،15،16،17،18،19، 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27.}الأساس المنطقي وراء دراسة تجميع البروتين عن طريق AFM هو أن هذا النهج يتيح التحقيق في مورفولوجيا الأنواع الفردية الموجودة في الحل^{13،14،16، 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31،32،33،34،35،36،37.} على وجه الخصوص، من خلال رصد العينة كدالة للوقت، يسمح AFM بالتحقيق في تطور مورفولوجيا الأنواع داخل العينة، مما يجعل من الممكن متابعة وتصور مسارات تشكيل الأميلويد^{23، 25،38،39،40،41،42.} وعلاوة على ذلك، يتيح AFM التحديد الكمي للمعلمات الهيكلية مثل ارتفاعات وأطوال الأنواع الفردية الموجودة في الحل^{13و19و30و31 ،32،33،34،35،36،37،40،43، 44 , 45 , 46 , 47 , 48}– غير أن دراسة خاصية فيزيائية حيوية واحدة، مثل علم المورفولوجيا، كثيرا ما لا تكون كافية عند دراسة النظم البيولوجية غير المتجانسة والمعقدة. طرق التصوير AFM أو SEM أو TEM وحدها لا تكشف بسهولة عن الخصائص الكيميائية للأنواع غير المتجانسة من المجاميع الأميلويد على مقياس النانو.

وقد أحرز تقدم كبير لتحليل العينات البيولوجية غير المتجانسة على هذا النطاق في الآونة الأخيرة مع تطوير وتطبيق في مجال تجميع البروتين من التصوير النانوبي بالأشعة تحت الحمراء (AFM-IR)^{24،26، 38،42،49،50،51،52.} يستغل هذا الأسلوب المبتكر الجمع بين الاستبانة المكانية لـ AFM (حوالي 1-10 نانومتر) مع قوة التحليل الكيميائي للالأشعة تحت الحمراء. وتستند تقنية AFM-IR إلى قياس تأثير الرنين المستحث بالحرارة الضوئية مدفوعاً بليزر الأشعة تحت الحمراء، وإلى قياس التوسع الحراري للعينة قيد التحقيق من طرف AFM. يمكن إضاءة العينة بواسطة ليزر الأشعة تحت الحمراء مباشرة من أعلى أو من أسفل في انعكاس داخلي كامل، وبالمثل كما هو الحال في مطياف الأشعة تحت الحمراء التقليدية^{24،42،52،53} . يمكن نبض ليزر الأشعة تحت الحمراء بترددات نموذجية بحسب مئات الكيلوهرتز (1-1000 كيلوهرتز) وضبطه على نطاق طيفي واسع، عادة بين 1000-3300 سم^-1. على الرغم من أن مصدر الليزر يغطي مساحة تبلغ حوالي 30 درجة مئوية، يتم تحديد الاستبانة المكانية لتقنية AFM-IR اسمياً من خلال قطر طرف AFM، الذي يكشف التوسع الحراري المحلي للنظام. AFM-IR مناسبة تماما لدراسة العينات البيولوجية لأن إشارة الأشعة تحت الحمراء يتناسب مع سمكها تصل إلى 1-1.5 ميكرومتر، وأطياف الأشعة تحت الحمراء الناتجة عموما تتفق مع أطياف الإرسال FTIR المقابلة^{13،54 ،55}. ولهذا السبب، يمكن تطبيق أساليب التحليل المعمول بها في التحليل الطيفي بسهولة، مثل دراسة التحولات الكيميائية، وتغيير شكل النطاق، وفك الإلتواء عن طريق تحليل المشتقات الثانية^52. وعموما، فإن الجمع بين الاستبانة المكانية للمركبات المضادة للمواد الكيميائية وقوة التعرف الكيميائي على مطياف الأشعة تحت الحمراء، يتيح AFM-IR الحصول في وقت واحد على مجموعة واسعة من الخصائص المورفولوجية والميكانيكية والكيميائية لعينة على مقياس النانو.

هنا، نقوم بتوضيح بروتوكول لتوصيف عملية تجميع البروتين الذي يستغل مزيج من اختبارات الفلورة في المختبر، والتصوير عالي الدقة AFM والأشعة تحت الحمراء نانوية AFM. وقد برع هذا النهج المشترك بالفعل في تقديم نتائج مفصلة في دراسة الخصائص الكيميائية والهيكلية للقطرات الصغيرة الفردية التي شكلتها المجاميع البروتين، في دراسة فصل مرحلة البروتين السائل السائل، وفي التحقيق في التغايرية والخصائص الفيزيائية الحيوية للأنواع المجمعة الفردية في النانومقياس^{23،26،38،45،50،53، 56و57}.