Caratterizzazione dei trasportatori a membrana di Eterologous Expression in E. coli e produzione di membrane

Le proteine coinvolte nel traffico di metaboliti costituiscono un livello essenziale di regolazione fisiologica, ma la stragrande maggioranza dei trasportatori di membrana vegetale non è ancora stata caratterizzata funzionalmente. Sono state implementate diverse strategie per caratterizzare nuove proteine da trasporto. Espressione etetologa in organismi modello come E. coli e cellule eucariotiche come lievito, Enopus oocyte, cellule di mammiferi, cellule di insetti e cellule vegetali sono stati tutti utilizzati per determinare la loro attività di trasporto¹. Le cellule eucariotiche sono favorite per l’espressione di proteine eucariotiche, perché la composizione cellulare di base, i percorsi transducivi del segnale, la trascrizione e la traduzione di macchine automatiche sono compatibili con le condizioni native.

Il lievito è stato un importante organismo modello per la caratterizzazione di nuove proteine di trasporto nelle piante. La prima proteina per il trasporto vegetale che è stata espressa con successo nel lievito (Saccharomyces pombe) è stata il trasportatore esososo HUP1 da Chlorella². Da allora, molte proteine del trasporto vegetale sono state caratterizzate funzionalmente utilizzando un sistema di espressione del lievito. Questi includono, trasportatori di zucchero vegetale (SUC1 e SUC2³, VfSUT1 e VfSTP1⁴) e i trasportatori di auxina (AUX1 e PIN⁵). Svantaggi di utilizzare il lievito per esprimere le proteine vegetali possono includere l’attività alterata delle proteine plastidi-localizzate perché il lievito manca di questo organello, mistargeting⁶, e la formazione di aggregati piegati male e l’attivazione delle risposte allo stress nel lievito a causa della sovraespressione delle proteine della membrana^7,8,9.

L’espressione etetologa delle proteine da trasporto negli evociti Xenopus è stata ampiamente utilizzata per la caratterizzazione elettrofisiologica dei trasportatori¹⁰. Le prime proteine del trasporto vegetale caratterizzate dall’espressione eteologa negli ovociti di Xenopus sono state il canale di potassio arabidopsis KAT1¹⁰ e il trasportatore esaso dell’Arabidopsis STP1¹¹. Da allora, gli evociti Xenopus sono stati impiegati per caratterizzare molte proteine del trasporto vegetale come trasportatori di membrana plasmatica¹², trasportatore di saccarosio vacuolare SUT4¹³ e trasportatore vacuolar malate ALMT9¹⁴. Un’importante limitazione degli evociti Xenopus per i saggi di trasporto è che la concentrazione di metaboliti intracellulari non può essere manipolata¹. Inoltre, le conoscenze professionali sono necessarie per preparare gli evociti Xenopus e la variabilità dei lotti di ovociti è difficile da controllare.

L’espressione eterologa nell’organismo modello E. coli è un sistema ideale in termini di caratterizzazione di nuove proteine di trasporto vegetale. Con un genoma completamente sequenziato¹⁵, le caratteristiche molecolari e fisiologiche di E. coli sono ben note. Gli strumenti e le tecniche molecolari sono ben definiti¹⁶. Inoltre, diversi vettori di espressione, ceppi non patogeni e mutanti sono disponibili^17,18,19. Inoltre, E. coli ha un alto tasso di crescita e può essere facilmente coltivato in condizioni di laboratorio. Molte proteine possono essere facilmente espresse e purificate a elevate quantità in E. coli⁹. Quando le proteine non possono essere analisi direttamente nei sistemi cellulari, la ricostituzione delle proteine in liposomi è stata anche un’innovazione di successo, anche se impegnativa, per la caratterizzazione delle proteine della membrana purificate. Caratterizzazione funzionale delle proteine di trasporto mitocondriali vegetali tra cui trasportatori soluti come trasportatori di fosfati in soia, mais, riso e arabidopsis, vettore dicarboxylate-tricarboxylate in Arabidopsis sono stati realizzati utilizzando questo sistema modello^20,21. Tuttavia, le proteine ricombinanti della proteina pomodoro SICAT9 sono risultate non funzionali negli esperimenti di ricostituzione, e altri membri della famiglia dei trasportatori CAT sono stati trovati non funzionali nei saggi di Xenopus oocyte²². Pertanto, sono necessari ulteriori strumenti molecolari per la caratterizzazione dei trasportatori di membrana.

Cinque sistemi di trasporto della poliammina si trovano in E. coli²³. Essi comprendono due trasportatori ABC che mediano l’assorbimento di spermidina e putrescina, uno scambiatore putrescina/ornitina, uno scambiatore di cadaverina/lisina, un esportatore di spermidine e un importatore di putrescina. Lo scambiatore putrescine PotE è stato originariamente caratterizzato utilizzando un saggio vescino, dove vescicoli all’interno verso l’esterno sono stati preparati da cellule liscicon con una pressa francese e misurando l’assorbimento di putrescina radioetichettata nelle vesciche in cambio di ornina²⁴. I saggi vescicoli sono stati utilizzati anche per caratterizzare un trasportatore di calcio, che mediava il trasporto di calcio in risposta a un gradiente protonico²⁵. Questi esperimenti ci hanno spinto a sviluppare una strategia per la caratterizzazione di altri scambiatori di poliamina. Per prima cosa abbiamo creato un ceppo di Scambiatori Di E. coli carenti in Scambiatori PotE e CadB. Qui, dimostriamo la caratterizzazione funzionale di un antiportatore di poliammina vegetale per espressione eteloga nel ceppo E. coli modificato, generazione di vesciche a membrana utilizzando una pressa francese e saggi radioetichettati.