Charakterisierung von Membrantransportern durch heterologen Ausdruck in E. coli und Herstellung von Membranvesikeln

Proteine, die am Handel mit Metaboliten beteiligt sind, stellen ein wesentliches Maß an physiologischer Regulation dar, aber die überwiegende Mehrheit der Pflanzenmembrantransporter ist noch nicht funktionell charakterisiert. Mehrere Strategien wurden implementiert, um neuartige Transportproteine zu charakterisieren. Heterologe Expression in Modellorganismen wie E. coli und eukaryotischen Zellen wie Hefe, Xenopus Oozyten, Säugetierzellen, Insektenzellen und Pflanzenzellen wurden alle verwendet, um ihre Transportaktivität zu bestimmen¹. Eukaryotische Zellen werden für die Expression von eukaryotischen Proteinen bevorzugt, da die grundlegende zelluläre Zusammensetzung, Signaltransducing-Pfade, Transkription und Übersetzungsmaschinen mit den nativen Bedingungen kompatibel sind.

Hefe war ein wichtiger Modellorganismus für die Charakterisierung neuartiger Transportproteine in Pflanzen. Das erste Pflanzentransportprotein, das erfolgreich in Hefe exprimiert wurde (Saccharomyces pombe) war der Hexose-Transporter HUP1 von Chlorella². Seitdem wurden viele Pflanzentransportproteine funktionell mit einem Hefeexpressionssystem charakterisiert. Dazu gehören Pflanzenzuckertransporter (SUC1 und SUC2³, VfSUT1 und VfSTP1⁴) und die Auxin-Transporter (AUX1 und PIN⁵). Nachteile der Verwendung von Hefe, um pflanzliche Proteine auszudrücken, können eine beeinträchtigte Aktivität von plastid-lokalisierten Proteinen umfassen, da Hefe diese Organelle fehlt, Fehlausrichtung⁶, und Bildung von falsch gefalteten Aggregaten und Aktivierung von Stressreaktionen in Hefe aufgrund der Überexpression von Membranproteinen^7,8,9.

Heterologe Expression von Transportproteinen in Xenopus Oozyten wurde häufig für die elektrophysiologische Charakterisierung von Transportern¹⁰verwendet. Die ersten pflanzentransportinochig charakterisierten Pflanzentransportproteine, die mit heterologer Expression in Xenopus oocyten charakterisiert wurden, waren der Arabidopsis Kaliumkanal KAT1¹⁰ und der Arabidopsis Hexose Transporter STP1¹¹. Seitdem wurden Xenopus Oozyten eingesetzt, um viele Pflanzentransportproteine wie Plasmamembrantransporter¹², Vacuolar-Saccharosetransporter SUT4¹³ und Vacuolar-Malattransporter ALMT9¹⁴zu charakterisieren. Eine wichtige Einschränkung von Xenopus Oozyten für Transporttests ist, dass die Konzentration von intrazellulären Metaboliten nicht manipuliert werden kann¹. Darüber hinaus sind professionelle Kenntnisse erforderlich, um Xenopus Oozyten vorzubereiten, und die Variabilität der Eizellenchargen ist schwer zu kontrollieren.

Heterologe Expression im Modellorganismus E. coli ist ein ideales System in Bezug auf die Charakterisierung neuartiger Pflanzentransportproteine. Mit einem vollständig sequenzierten Genom¹⁵sind die molekularen und physiologischen Eigenschaften von E. coli bekannt. Molekulare Werkzeuge und Techniken sind gut etabliert¹⁶. Darüber hinaus stehen verschiedene Expressionsvektoren, nichtpathogene Stämme und Mutanten zur Verfügung^17,18,19. Darüber hinaus hat E. coli eine hohe Wachstumsrate und kann leicht unter Laborbedingungen angebaut werden. Viele Proteine können leicht in hohen Mengen in E. coli⁹exprimiert und gereinigt werden. Wenn Proteine nicht direkt in zellulären Systemen untersucht werden können, war die Rekonstitution von Proteinen zu Liposomen auch eine erfolgreiche, wenn auch herausfordernde Innovation für die Charakterisierung gereinigter Membranproteine. Die funktionelle Charakterisierung der mitochondrialen Transportproteine der Pflanze einschließlich gelöster Transporter wie Phosphattransporter in Sojabohnen, Mais, Reis und Arabidopsis, Dicarboxylat-Tricarboxylatträger in Arabidopsis wurde mit diesem Modellsystem^20,21erreicht. Jedoch, rekombinante Proteine des Tomatenproteins SICAT9 wurden festgestellt, dass nicht funktional in Rekonstitutionsexperimente, und andere Mitglieder der CAT-Transporter-Familie wurden gefunden, um nicht funktional in Xenopus Oozyten-Assays²². Daher werden zusätzliche molekulare Werkzeuge für die Charakterisierung von Membrantransportern benötigt.

Fünf Polyamin-Transportsysteme sind in E. coli²³zu finden. Dazu gehören zwei ABC-Transporter, die die Aufnahme von Spermidin und Putrescin vermitteln, einen Putrescine/Ornithin-Austauscher, einen Kadaverin/Lysinaustauscher, einen Spermidinexporteur und einen Putrescine-Importeur. Der Putrescine-Austauscher PotE wurde ursprünglich mit einem Vesikel-Assay charakterisiert, bei dem von innen nach außen Vesikel durch Lysingzellen mit einer französischen Presse hergestellt und die Aufnahme von radioaktiv markiertem Putrescin in die Vesikel im Austausch gegen Ornithin²⁴gemessen wurden. Vesikel-Assays wurden auch verwendet, um einen Kalziumtransporter zu charakterisieren, der den Transport von Kalzium als Reaktion auf einen Protonengradienten^{vermittelte 25}. Diese Experimente veranlassten uns, eine Strategie für die Charakterisierung anderer Polyaminaustauscher zu entwickeln. Wir haben zuerst einen Stamm von E. coli-Mangel an PotE- und CadB-Austauschern entwickelt. Hier zeigen wir die funktionelle Charakterisierung eines Pflanzenpolyamin-Antiporters durch heterlogen Ausdruck im modifizierten E. coli-Stamm, die Erzeugung von Membranbläschen mit einer französischen Presse und radioaktiv markierte Assays.