Caractérisation des transporteurs de membrane par l'expression hétérologue dans E. coli et la production de vésicules membranaires

Les protéines impliquées dans le trafic de métabolites constituent un niveau essentiel de régulation physiologique, mais la grande majorité des transporteurs de membranes végétales n’ont pas encore été caractérisés fonctionnellement. Plusieurs stratégies ont été mises en œuvre pour caractériser les nouvelles protéines de transport. L’expression hétérologue dans les organismes modèles tels que E. coli et les cellules eucaryotes telles que la levure, les ovocytes Xenopus, les cellules de mammifères, les cellules d’insectes et les cellules végétales ont tous été utilisés pour déterminer leur activité de transport¹. Les cellules eucaryotes sont favorisées pour l’expression des protéines eucaryotes, parce que la composition cellulaire de base, les voies de transduire de signal, la transcription et les machines de traduction sont compatibles avec les conditions indigènes.

La levure a été un organisme modèle important pour la caractérisation de nouvelles protéines de transport chez les plantes. La première protéine de transport de plantes qui a été exprimée avec succès dans la levure (Saccharomyces pombe) était le transporteur de hexose HUP1 de Chlorella². Depuis lors, de nombreuses protéines de transport de plantes ont été fonctionnellement caractérisées à l’aide d’un système d’expression de levure. Il s’agit notamment des transporteurs de sucre végétal (SUC1 et SUC2³, VfSUT1 et VfSTP1⁴) et les transporteurs d’auxin (AUX1 et PIN⁵). Les inconvénients de l’utilisation de levure pour exprimer les protéines végétales peuvent inclure l’activité altérée des protéines plastides localisées parce que la levure manque de cette organelle, mal cibler⁶, et la formation d’agrégats mal repliés et l’activation des réponses de stress dans la levure en raison de la surexpression des protéines membranaires^7,8,9.

L’expression hétérologue des protéines de transport dans les ovocytes Xenopus a été largement utilisée pour la caractérisation électrophysiologique des transporteurs¹⁰. Les premières protéines de transport de plantes caractérisées à l’aide d’une expression hétérologue dans les ovocytes Xenopus étaient le canal de potassium D’Arabidopsis KAT1¹⁰ et le transporteur d’hexose Arabidopsis STP1¹¹. Depuis lors, les ovocytes Xenopus ont été utilisés pour caractériser de nombreuses protéines de transport de plantes telles que les transporteurs de membrane splamine¹², transporteur de saccharose vacuolaire SUT4¹³ et transporteur de malate vacuolaire ALMT9¹⁴. Une limitation importante des ovocytes Xenopus pour les essais de transport est que la concentration de métabolites intracellulaires ne peut pas être manipulée¹. En outre, des connaissances professionnelles sont nécessaires pour préparer les ovocytes Xenopus et la variabilité des lots d’ovocytes est difficile à contrôler.

L’expression hétérologue dans l’organisme modèle E. coli est un système idéal en termes de caractérisation des nouvelles protéines de transport des plantes. Avec un génome entièrement séquencé¹⁵, les caractéristiques moléculaires et physiologiques d’E. coli sont bien connues. Les outils et les techniques moléculaires sont bien établis¹⁶. En outre, différents vecteurs d’expression, souches non pathogènes et mutants sont disponibles^17,18,19. En outre, E. coli a un taux de croissance élevé et peut être facilement cultivé dans des conditions de laboratoire. De nombreuses protéines peuvent être facilement exprimées et purifiées en grandes quantités dans E. coli⁹. Lorsque les protéines ne peuvent pas être astorquées directement dans les systèmes cellulaires, la reconstitution des protéines en liposomes a également été une innovation réussie, bien que difficile pour la caractérisation des protéines membranaires purifiées. La caractérisation fonctionnelle des protéines de transport mitochondrial des plantes, y compris les transporteurs de solutés tels que les transporteurs de phosphate dans le soja, le maïs, le riz et l’arabidopsis, le transporteur de dicarboxylate-tricarboxylate dans Arabidopsis ont été accomplies en utilisant ce système modèle^20,21. Cependant, les protéines recombinantes de la protéine de tomate SICAT9 se sont avérées non fonctionnelles dans les expériences de reconstitution, et d’autres membres de la famille de transporteur de CAT se sont avérés non fonctionnels dans Xenopus oocyte s’indique^22. Ainsi, des outils moléculaires supplémentaires sont nécessaires pour la caractérisation des transporteurs de membranes.

Cinq systèmes de transport de polyamine se trouvent dans E. coli²³. Il s’agit de deux transporteurs ABC médiateurs de l’apport de spermidine et de putrescine, d’un échangeur de putrescine/ornithine, d’un échangeur de cadaverine/lysine, d’un exportateur de spermidine et d’un importateur de putrescine. L’échangeur de putrescine PotE a été caractérisé à l’origine à l’aide d’un étosay vésicule, où l’intérieur des vésicules ont été préparés en lysing cellules avec une presse Français et de mesurer l’utilisation de putrescine radiolabeled dans les vésicules en échange de l’ornithine²⁴. Des essais de vésicule ont également été utilisés pour caractériser un transporteur de calcium, qui a négocié le transport du calcium en réponse à un gradient de proton²⁵. Ces expériences nous ont incités à développer une stratégie pour la caractérisation d’autres échangeurs de polyamines. Nous avons d’abord créé une souche de E. coli déficiente chez les échangeurs de PotE et de CadB. Ici, nous démontrons la caractérisation fonctionnelle d’un antiporteur de polyamine de plante par l’expression hétérologue dans la souche modifiée d’E. coli, la génération des vésicules de membrane utilisant une presse Français, et les essais radiolabeled.