초적혈구 멜라노가스터의생존능력을 배아에서 성인으로 평가하는 직접적이고 간단한 방법
Summary
이 프로토콜은 배아에서 성인에 이르기까지 모든 발달 단계에서 Drosophila의 생존 가능성을 평가하기 위해 고안되었습니다. 이 방법은 상이한 유전자형 또는 성장 조건의 생존 가능성을 결정하고 비교하는 데 사용될 수 있다.
Abstract
Drosophila melanogaster에서,생존성 시험은 특정 유전 배경의 적합성을 결정하기 위하여 이용됩니다. 말기 변형은 개발의 다른 단계에서 생존의 부분적 또는 완전한 손실을 초래할 수 있습니다. 우리의 실험실은 완전히 성숙한 성인에 태아에서 Drosophila에 있는 생존을 평가하는 방법을 개발했습니다. 이 방법은 부화 된 배아로 시작하여 개발 중에 다른 단계에서 존재하는 자손의 수를 정량화하는 데 의존합니다. 배아가 정량화된 후에는 L1/L2, 번데기 및 성숙한 성인을 포함하여 추가 단계가 계산됩니다. 모든 단계를 검토 한 후, 카이 스퀘어 테스트와 같은 통계 분석은 자손 (부화 배아)의 시작 수와 관찰 된 성인 의 수에서 절정에 이르는 후기 단계 사이에 유의한 차이가 있는지 여부를 결정하는 데 사용됩니다. 따라서 null 가설을 거부하거나 수락합니다 (부화 된 배아의 수는 개발 단계에 걸쳐 기록 된 애벌레, 번데기 및 성인의 수와 동일합니다). 이 분석의 주요 장점은 기술적 인 오류로 인한 손실을 피하기 위해 배아 헹죄가 식품 바이알로 옮길 필요가 없기 때문에 단순성과 정확성입니다. 여기에 설명된 프로토콜은 L2/L3 애벌레를 직접 검사하지는 않지만 이를 설명하기 위해 추가 단계를 추가할 수 있습니다. 부화한 배아, L1, pupae 및 성인의 수를 비교하면 추가 연구를 위해 L2/L3 단계에서 생존가능성이 손상되었는지 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다(유충을 시각적으로 식별하는 데 도움이 되는 유충의 사용). 전반적으로, 이 방법은 Drosophila 연구원 및 교육자가 비행 수명 주기 도중 생존이 손상되는 때 결정하는 것을 도울 수 있습니다. 이 분석종을 사용하여 주식의 일상적인 평가는 본래 돌연변이가 적중에 영향을 미치는 경우에 특히, 원래 고립된 돌연변이의 표현형에 영향을 미칠 수 있는 이차 돌연변이의 축적을 방지할 수 있습니다. 이러한 이유로, 우리의 실험실은 우리의 Dm ime4 alleles의 각의 다중 사본을 유지하고 정기적으로 다른 분자 분석 이외에이 방법으로 각 주식의 순도를 확인합니다.
Introduction
수명은 유전및 비유전적 요인에 의해 영향을 받습니다. 실온의 표준 실험실 성장 조건에서, 우리 실험실은 동일한 조건에서 재배된 다른 Dm ime4 대립구체 들 사이에서 체력과 생존율의 상당한 변화를 관찰했습니다 (그림1 및 보충수치). 생존성 연구는 인구 유전 연구에서 특정 대말류 조합 또는 성장 상태의효과를 조사하기 위해 자주 수행된다 1,2,3,4. 그러나, 돌연변이의 비 보완적인 단 내의 생존의 상세한 분석은 과학 문헌에서 찾아내기 어렵습니다. 대립계종종은 일반적으로 연구원이 균형 잡힌 주식5,6을수용하는 음식 유리병 내의 그 대립 구균에 대한 몇 가지 개인 동형접합을 발견하면 “필수적이지 않은”이라고 표시됩니다. 그러나, 정확한 카이스퀘어 분석은 이러한 동형접합체가 예상되는 멘델리안 비율에서발생하는지 여부를 평가하기 위한 5,6. 모든 Drosophila 주식에 대한 가장 허용 온도는 실온 (22-23 °C)이며, 적절한 영양소와 함께, 야생 형파리의 수명 주기는 7,8을완료하는 데 약 12 일이 걸립니다. 야생형 초파리의 각 발달단계의 지속기간이 7,8로 알려져 있기 때문에, 이 보고서에 기재된 방법은 연구 중인 초파리 균주가 각 단계에 적합한지 여부를 조사하는데 사용될 수 있다. 테스트 된 유전 적 배경에 적합한 대조군과 비교하십시오. 개발 9의 한 특정 측면에 초점을맞춘 연구와는 달리,이 프로토콜은 다른 발달 단계에서 생존가능성을 평가하는 실용적인 방법을 제공합니다.
우리의 실험실에서, 이 프로토콜은 Meiosis 4(Dm ime4)의Drosophila 유도제에 대한 결핍 주식의 생존가능성을 평가하는 데 사용됩니다. Dm ime4는 Drosophila 및 그밖 다세포 유기체에 있는 RNA 물질 대사에 있는 중요한 역할을 가진 RNA 메틸 트랜스퍼라제를 부호매이는 필수적인 유전자 10,5, 6,10, 11세 , 12세 , 13세 , 14세 . CRISPR/Cas9(보충 수치)를 통해 생성된 Dm ime4의 새로운 대립유전자를 신속하게 평가하기 위해, 균형 잡힌 주식의 바이알 내에서 생성된 성인 자손만 을 계산하는 종점 생존성 분석이 수행되었다(도1). 사용 된 주식의 일부는 이전 DM ime4 보고서5,6에설명되었다 . 동형접합체 돌연변이체는 카이스퀘어 분석(그림1 및 보충물질)에 의해 결정된 바와 같이, 아멘델리안 수준에서 나타났다. 예상보다 낮은 숫자가 누워있는 배아의 수가 적거나 부화된 배아가 적거나 L1/L2 또는 번데기의 생존 력 상실로 인한 것인지 를 평가하기 위해추적을 확장하여 각 발달 단계에 대한 카운트를 포함시켰습니다(그림 2) 그림3, 그림4, 그림5, 그림6, 그림7, 그림 8및 그림9).
여기서, 야생형(OreR) 파리를 이용한 방법을 설명한다. 경험적으로 다른 유전 적 배경이나 Drosophila 종과 함께 사용하기 위해이 방법을 테스트하려면, 우리는 참조로 OreR을 사용하고 실험 유기체에 따라 시간을 조정하는 것이 좋습니다. 프로토콜은 이형 Dm ime4 돌연변이 스톡5,6 (도 4)에서 남성과 처녀 야생형 암컷을 교차시킴으로써 생성된 자손의 생존가능성을 평가하기 위해 추가로 평가되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
요약하면,이 방법은 Drosophila에서생존가능성에 대한 정확하고 간단한 평가를 제공합니다. 전체 프로토콜을 완료하는 데 약 14일이 걸립니다. 이 절차는 전문적인 기술 기술이 필요하지 않습니다. 그러나 적절한 타이밍, 일일 관찰 일정 및 신중한 한천 이송은 정확성과 재현성을 위해 중요합니다.
식품 바이알에서 포도-한천 디스크 배아측을 아래로 배치하는 것 외에도, 절차의 또 다른 중요한 단계는 배아 수집 미니 케이지로부터 포도 한천 플레이트를 제거한 후 48시간 이상 음식 바이알로 한천 디스크를 이송하는 것입니다. 48 시간 후에 한천을 옮기는 것은 한천 디스크의 탈수로 인해 배아 및 유충 손실을 초래했습니다. L2/L3 전환을 계산하려면 플레이트가 72시간 동안 배양해야 합니다. 이 단계가 중요한 경우, 포도 한천 접시를 두껍게 부어야하고 습한 챔버는 탈수 방지를 위해 사용해야합니다. 십자가는 35mm 판을 수용하는 배아 수집 케이지에 설치되었다; 그러나, 이 절차는 60 mm 또는 100 mm 페트리 플레이트를 수용하는 것과 같은 더 큰 배아 수집 케이지를 사용하여 수행 될 수있다. 그런 다음 식품 병은 그 크기를 수용 할 수있을만큼 커야합니다.
이 프로토콜에 추가할 수 있는 단계가 있습니다. 위에서 언급했듯이 L2/L3 전환은 필요한 시간과 한천의 잠재적 탈수로 인해 플레이트에서 정량화하기가 어렵습니다. 또한, 애벌레는 한천의 표면에 매우 이동이될, 정확하게 그들을 계산하는 도전을 포즈. 30 분 동안 냉장고에 접시를 배치하거나 L2 / L3 유충을 계산하기 전에 한천의 표면에 가벼운 마취제 (리도카인 용액)의 몇 방울을 추가하면 더 정확하게 계산하기 위해 자신의 움직임을 느리게 할 수 있습니다. 이러한 수정에 주의해야 할 점은 변수(감기 민감도, 마취 감도)를 도입하고 실행 가능성 결과를 혼동할 수 있다는 것입니다. 이러한 단계 없이도, 색깔음식을 사용하여, 연구원은 pupation를 시작하기 위하여 음식 유리병의 측에 정착할 때 방황하는 L3s/prepupae를 정량화할 수 있습니다. 이 방법에 대한 제한은 배아 수집 케이지에서 십자가를 설정하기 위해 PHENOTyping을 위해 CO2로 마취되는 생존을 위해 십자가에 사용되는 성인을 필요로한다는 것입니다. Dm ime4 동형접합체 돌연변이 남성은 CO2 치료에서 깨어난 후 잘 회복되고 몇 시간 후에 죽지 않는다. 선별을 위해 성인을 고정시키는 다른 방법은 몇 분 동안 냉장고에 바이알을 넣은 다음 바이알을 분쇄된 얼음으로 옮겨 이동을 늦추고 빠르고 효율적으로 분류하는 것과 같은 방법을 탐색할 수 있습니다.
이 방법은 알릴 수 있는 강점과 생존 가능성에 미치는 영향을 비교하는 것 외에도 정의된 제약 화합물에 대한 민감도 또는 저항성을 스크리볼에 사용할 수 있습니다. 세포 배양15,16,17,18에서화합물 독성을 가리는 다른 방법과 달리이 방법은 전체 유기체를 사용하여 발달 효과를 쉽게 분석 할 수 있습니다. 요약하면, 이 프로토콜 및 그 안에 수정을 사용하여, 초경 적 생존력, 여성, 불임, 수명 및 기간에 대한 환경 요인 및 화학 화합물의 효과뿐만 아니라 알레르적 강도를 측정 할 수 있습니다. 개발 주기.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리의 일은 CFH와 NIH PA -12-149에 NIH 1R15GM1131-01에 의해 CFH에 투자됩니다.
Materials
| Antimold additive | Carolina | ||
| Beaker | Fisher Scentific | S76100J | Beaker |
| Benchmark scientific digital hotplate | The Lab Depot | H3760H | Hot plate |
| Britta-filtered tap water to prepare grape agar and instant fly food | Any tap water filtration system | ||
| CO2 pistol or FlyNap | Carolina | Anesthetic to sort/count adult flies | |
| Dissecting microscope/stereoscope | Amscope | SM-1TSZ-V203 | Dissecting microscope |
| Drosophila culture vials and stoppers | Carolina | 173120 | Food vials for growing Drosophila |
| Embryo collection mini cage | Genesee Scientific | 59-105 | chamber used to gather embryos |
| Erlenmeyer flask | Sigma-Aldrich | 70980 | Erlenmeyer flask |
| Formula 4-24 Instant Drosophila Medium, Blue | Carolina | https://www.carolina.com/drosophila-fruit-fly-genetics/formula-4-24-drosophila-medium-blue/FAM_173210.pr | |
| Grape agar | Genesee Scientific | 47-102 | Media used for agar plates |
| Instant fly flood | Carolina | 173210 | Blue media for food vials |
| Large Petri dish or any clear container to be used as a humid chamber by placing wet paper towels to keep the grape-agar plates moist during incubation/pre and post microscopic observation | |||
| Metal spatula (small) | Carolina | ||
| Microwave | Any | To cook grape agar | |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2901 | Petri dish for grape agar |
| Stir bar | The Lab Depot | 58948-981-EA | Magnetic stir bar |
References
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