طريقة مباشرة وبسيطة لتقييم قدرة دروسوفيلا ميلانوغاسترعلى البقاء من الجنين إلى الكبار
Summary
تم تصميم هذا البروتوكول لتقييم صلاحية دروسوفيلا في كل مرحلة من مراحل النمو، من الجنين إلى الكبار. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد ومقارنة صلاحية مختلف الأنماط الجينية أو ظروف النمو.
Abstract
في دروسوفيلا melanogaster، وتستخدم اختبارات الجدوى لتحديد اللياقة البدنية لبعض الخلفيات الوراثية. ويمكن أن تؤدي الاختلافات الأليلية إلى فقدان جزئي أو كامل للقدرة على البقاء في مراحل مختلفة من التنمية. وقد طور مختبرنا طريقة لتقييم الجدوى في دروسوفيلا من الجنين إلى البالغين الناضجين بالكامل. تعتمد هذه الطريقة على تحديد عدد الذرية الموجودة في مراحل مختلفة أثناء النمو، بدءاً من الأجنة المفقسة. بعد أن يتم تحديد الأجنة كمياً، يتم حساب مراحل إضافية، بما في ذلك L1/L2، والجرو، والبالغين البالغين. بعد فحص جميع المراحل، يتم استخدام تحليل إحصائي مثل اختبار تشي سكوير لتحديد ما إذا كان هناك فرق كبير بين العدد الأولي للذرية (الأجنة المفقسة) والمراحل اللاحقة التي بلغت ذروتها في عدد البالغين الملاحظ، وبالتالي رفض أو قبول الفرضية الفارغة (أن عدد الأجنة المفقسة سيكون مساويا ً لعدد اليرقات والجراء والبالغين المسجلين طوال مراحل النمو). الميزة الأساسية لهذا الاختبار هو بساطته ودقته، كما أنه لا يتطلب شطف الجنين لنقلها إلى قارورة الغذاء، وتجنب الخسائر الناجمة عن الأخطاء التقنية. وعلى الرغم من أن البروتوكول الوارد وصفه هنا لا يفحص مباشرة يرقات L2/L3، يمكن إضافة خطوات إضافية لمراعاة هذه اليرقات. مقارنة عدد الأجنة المفقسة، L1، الجراء، والبالغين يمكن أن تساعد في تحديد ما إذا كانت قابلة البقاء للخطر خلال مراحل L2/L3 لمزيد من الدراسات (استخدام المواد الغذائية الملونة يساعد في التعرف البصري لليرقات). بشكل عام، يمكن أن تساعد هذه الطريقة الباحثين Drosophila والمربين تحديد متى يتم اختراق القدرة على البقاء خلال دورة حياة ذبابة. التقييم الروتيني للمخزونات باستخدام هذا الفحص يمكن أن يمنع تراكم الطفرات الثانوية التي قد تؤثر على النمط الظاهري للمتحولة المعزولة أصلا، وخاصة إذا كانت الطفرات الأصلية تؤثر على اللياقة البدنية. لهذا السبب، يحتفظ مختبرنا بنسخ متعددة من كل من الأليلات Dm ime4 لدينا ويتحقق بشكل روتيني من نقاء كل مخزون مع هذه الطريقة بالإضافة إلى التحليلات الجزيئية الأخرى.
Introduction
يتأثر العمر بالعوامل الوراثية وغير الوراثية. في ظروف نمو المختبر القياسية في درجة حرارة الغرفة، لاحظ مختبرنا تباينًا كبيرًا في اللياقة البدنية والقدرة على البقاء بين مختلف الأليلDm ime4 المزروعة في ظل ظروف متطابقة (الشكل1 والأرقام التكميلية). وكثيرا ً ما يتم إجراء دراسات الجدوى للتحقيق في آثار تركيبة معينة من الأليل أو حالة نمو في الدراسات الوراثية السكانية1و2و3 و4. ومع ذلك، من الصعب العثور على تحليلات مفصلة للصلاحية داخل مجموعة غير متكاملة من الطفرات في المؤلفات العلمية. وعادة ما يسمى أليل “غير ضروري” إذا وجد الباحث عدد قليل من الأفراد homozygous لذلك أليل داخل قارورة الغذاء الذي يضم المخزون المتوازن5،6. ومع ذلك، لا يتم الإبلاغ عن تحليلات دقيقة تشي مربع لتقييم ما إذا كانت هذه homozygotes تنشأ في نسب Mendelian المتوقعة5،6. درجة الحرارة الأكثر تساهلا لأي مخزون Drosophila هو درجة حرارة الغرفة (22-23 درجة مئوية) ومع المواد الغذائية المناسبة، ودورة حياة الذباب البرية من نوع يستغرق ما يقرب من اثني عشر يوما لإكمال7،8. كما أن مدة كل مرحلة من مراحل النمو من البرية من نوع Drosophila هو معروف7،8، ويمكن استخدام الطريقة الموصوفة في هذا التقرير لدراسة ما إذا كان سلالة Drosophila قيد الدراسة يصلح في كل مرحلة بالمقارنة مع السيطرة المناسبة للخلفية الوراثية اختبارها. وعلى النقيض من الدراسات التي تركزعلى جانب محدد واحد من جوانب التنمية 9، يوفر هذا البروتوكول طريقة عملية لتقييم الجدوى في مختلف المراحل الإنمائية.
في مختبرنا، يتم استخدام هذا البروتوكول لتقييم جدوى الأسهم التي تعاني من نقص لمحفز دروسوفيلا من Meiosis 4 (Dm ime4). Dm ime4 هو جين أساسي10 الذي يشفر ميثيل ترانسفيراز RNA مع أدوار حاسمة في استقلاب الحمض النووي الريبي في دروسوفيلا وغيرها من الكائنات متعددة الخلايا5،6،10، 11 , 12 , 13 , 14 سنة . لتقييم بسرعة الأليلات الجديدة من Dm ime4 ولدت عن طريق كريسبر / Cas9 (الأرقامالتكميلية) ، تم إجراء اختبار الجدوى نقطة النهاية التي تحسب فقط ذرية الكبار المنتجة داخل قارورة من الأسهم المتوازنة (الشكل 1). وقد تم وصف بعض المخزونات المستخدمة في تقارير ألمانيا ime4 السابقة5و6. ظهرت المتحولين المتجانسين على مستويات شبه مندليان، كما هو محدد من قبل تحليلات تشي سكوير (الشكل1 والموادالتكميلية). لتقييم ما إذا كانت هذه الأرقام أقل من المتوقع كانت بسبب عدد أقل من الأجنة التي يتم زرعها، أو عدد أقل من الأجنة المفقسة، أو فقدان القدرة على البقاء في L1/L2 أو الجراء، قمنا بتوسيع نطاق التتبع ليشمل العد في كل مرحلة من هذه المراحل التنموية (الشكل2، الشكل3، الشكل4، الشكل5، الشكل6، الشكل7، الشكل8، والشكل 9).
هنا، ونحن نصف الطريقة باستخدام البرية من نوع الذباب (OreR). لاختبار هذه الطريقة تجريبيا للاستخدام مع الخلفيات الوراثية الأخرى أو الأنواع Drosophila، نوصي باستخدام OreR كمرجع وضبط النقاط الزمنية وفقا للكائن الحي التجريبي. كما تم تقييم البروتوكول لتقييم جدوى الذرية الناتجة عن عبور الإناث من النوع البري البكر مع الذكور من مخزون متحولة heterozygous Dm ime4 5و6 (الشكل4).
Protocol
Representative Results
Discussion
وباختصار، توفر هذه الطريقة تقييما دقيقا وبسيطا للصلاحية في دروسوفيلا. يستغرق البروتوكول بأكمله حوالي 14 يومًا لإكماله. ولا يتطلب هذا الإجراء مهارات تقنية من الخبراء؛ ومع ذلك، فإن التوقيت المناسب، وجدول زمني للملاحظات اليومية، ونقل أجار بعناية أمر مهم للدقة والتكرار.
بالإضافة إلى وضع قرص العنب أجار جانب الجنين أسفل في قارورة الغذاء، خطوة حاسمة أخرى في الإجراء هو نقل قرص أجار إلى قارورة الغذاء في موعد لا يتجاوز 48 ساعة بعد إزالة لوحة أجار العنب من أقفاص جمع الجنين مصغرة. نقل أجار بعد 48 ساعة أدى إلى فقدان الجنين واليرقات، على الأرجح بسبب الجفاف من قرص أجار. لحساب التحولات L2/L3، لوحة يحتاج إلى احتضان لمدة 72 ساعة. إذا كانت هذه المرحلة حاسمة، يجب سكب لوحات أجار العنب أكثر سمكا ويجب استخدام غرفة رطبة لمنع الجفاف. وقد أقيمت الصلبان في أقفاص لجمع الأجنة التي تستوعب لوحات 35 ملم؛ ومع ذلك، يمكن تنفيذ هذا الإجراء باستخدام أقفاص جمع الأجنة أكبر أيضا، مثل واحد الذي يستوعب 60 ملم أو 100 مم لوحات بيتري. ثم يجب أن تكون زجاجات الطعام كبيرة بما يكفي لاستيعاب تلك الأحجام.
هناك خطوات يمكن إضافتها إلى هذا البروتوكول. وكما ذُكر أعلاه، فإن التحولات L2/L3 تشكل تحدياً لتحديد كمي على الصفائح بسبب الوقت المطلوب والجفاف المحتمل للأجار. بالإضافة إلى ذلك، تصبح اليرقات متحركة للغاية على سطح أجار، مما يشكل تحديا لعدها بدقة. وضع لوحات في الثلاجة لمدة 30 دقيقة أو إضافة بضع قطرات من مخدر خفيف (محلول ليدوكائين) على سطح أجار قبل عد L2 /L3 اليرقات يمكن أن تساعد على إبطاء تحركاتها لحسابها بشكل أكثر دقة. تحذير لهذه التعديلات هو أنها يمكن أن تقدم متغيرات (حساسية الباردة، حساسية التخدير) والخلط بين نتائج الصلاحية. حتى من دون هذه الخطوات، وذلك باستخدام المواد الغذائية الملونة، يمكن للباحثين قياس تجول L3s / prepupae لأنها تستقر على جانب قارورة الغذاء لبدء الجرو. وهناك قيد على هذه الطريقة هو أنه يتطلب من البالغين المستخدمة في الصلبان البقاء على قيد الحياة يجري التخدير مع CO2 للنماذج الظاهرية لإعداد الصلبان في أقفاص جمع الأجنة. Dm ime4 homozygous متحولة الذكور لا يتعافى بشكل جيد ويموت بعد ساعات قليلة من الاستيقاظ من العلاج CO 2. ويمكن استكشاف طرق أخرى لشل حركة البالغين للفرز، مثل وضع قارورة في الثلاجة لبضع دقائق ثم نقل القنينات إلى الجليد المسحوق لإبطاء الحركة وفرز بسرعة وكفاءة.
وبصرف النظر عن مقارنة نقاط القوة الاليليك وآثارها على الجدوى، يمكن استخدام هذه الطريقة لفحص الحساسية أو المقاومة للمركبات الصيدلانية المحددة. خلافا للأساليب الأخرى التي شاشة سمية مركب في ثقافة الخلية15،16،17،18، وتستخدم هذه الطريقة الكائنات الحية بأكملها ، مما يجعل تقييم الآثار التنموية أسهل لتحليلها. وخلاصة القول، باستخدام هذا البروتوكول والتعديلات فيه، سوف تسمح لقياس نقاط القوة الاليليك، فضلا عن آثار العوامل البيئية والمركبات الكيميائية على قدرة Drosophila على البقاء، والخصوبة، والخصوبة، وعمر، ومدة دورة التنمية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم تمويل عملنا من قبل NIH 1R15GM1131-01 إلى CFH وNIH PA -12-149 إلى CFH.
Materials
| Antimold additive | Carolina | ||
| Beaker | Fisher Scentific | S76100J | Beaker |
| Benchmark scientific digital hotplate | The Lab Depot | H3760H | Hot plate |
| Britta-filtered tap water to prepare grape agar and instant fly food | Any tap water filtration system | ||
| CO2 pistol or FlyNap | Carolina | Anesthetic to sort/count adult flies | |
| Dissecting microscope/stereoscope | Amscope | SM-1TSZ-V203 | Dissecting microscope |
| Drosophila culture vials and stoppers | Carolina | 173120 | Food vials for growing Drosophila |
| Embryo collection mini cage | Genesee Scientific | 59-105 | chamber used to gather embryos |
| Erlenmeyer flask | Sigma-Aldrich | 70980 | Erlenmeyer flask |
| Formula 4-24 Instant Drosophila Medium, Blue | Carolina | https://www.carolina.com/drosophila-fruit-fly-genetics/formula-4-24-drosophila-medium-blue/FAM_173210.pr | |
| Grape agar | Genesee Scientific | 47-102 | Media used for agar plates |
| Instant fly flood | Carolina | 173210 | Blue media for food vials |
| Large Petri dish or any clear container to be used as a humid chamber by placing wet paper towels to keep the grape-agar plates moist during incubation/pre and post microscopic observation | |||
| Metal spatula (small) | Carolina | ||
| Microwave | Any | To cook grape agar | |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2901 | Petri dish for grape agar |
| Stir bar | The Lab Depot | 58948-981-EA | Magnetic stir bar |
References
- Hartung, E. W. Some observations on the larval growth rate and viability of two tumor strains of Drosophila melanogaster. Science. 107 (2777), 296-297 (1948).
- Moree, R., King, J. R. Experimental Studies on Relative Viability in Drosophila Melanogaster. Genetics. 46 (12), 1732-1752 (1961).
- Da Costa, M. V. Viability of F1 and F2 generations of crossed Drosophila and Oregon previously adapted to 2 different nutrient media. Comptes rendus de l’Académie des Sciences. 242 (1), 177-180 (1956).
- Garcia-Dorado, A., Caballero, A. The mutational rate of Drosophila viability decline: tinkering with old data. Genome Research. 8 (2), 99-105 (2002).
- Lence, T., et al. m6A modulates neuronal functions and sex determination in Drosophila. Nature. 540 (7632), 304-318 (2016).
- Haussmann, I. U., et al. m(6)A potentiates Sxl alternative pre-mRNA splicing for robust Drosophila sex determination. Nature. 54 (7632), 301-304 (2016).
- Stockwer, H., Gallant, P. Getting started: An overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).
- Hales, K. G., et al. Genetics on the Fly: A Primer on the Drosophila Model System. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- Gardner, M., et al. Genetic Variation for Preadult Viability in Drosophila melanogaster. Evolution. 55 (8), 1609-1620 (2001).
- Hongay, C. F., Orr-Weaver, T. L. Drosophila Inducer of MEiosis 4 (IME4) is required for Notch signaling during oogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14855-14860 (2011).
- Zhong, S., et al. MTA Is an Arabidopsis Messenger RNA Adenosine Methylase and Interacts with a Homolog of a Sex-Specific Splicing Factor. The Plant Cell. 5, 1278-1288 (2008).
- Wang, Y., et al. N6-methyladenosine modification destabilizes developmental regulators in embryonic stem cells. Nature Cell Biology. 16, 191-198 (2014).
- Hsu, P. J., Shi, H., He, C. Epitranscriptomics influence on development and disease. Genome Biology. 18 (197), 1-9 (2017).
- Kan, L., et al. The m6A pathway facilitates sex determination in Drosophila. Nature Communications. 8, 1-16 (2017).
- Senkowski, W., et al. Three-Dimensional Cell Culture-Based Screening Identifies the Anthelmintic Drug Nitazoxanide as a Candidate for Treatment of Colorectal Cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (6), 1504-1516 (2015).
- Ramasamy, S., Bennet, D., Kim, S. Drug and bioactive molecule screening based on a bioelectrical impedance cell culture platform. International Journal of Nanomedicine. 9, 5789-5809 (2014).
- Weltin, A., et al. Cell culture monitoring for drug screening and cancer research: a transparent, microfluidic, multi-sensor microsystem. Lab on a Chip. 14 (1), 138-146 (2014).
- Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
