Прямой и простой метод для оценки Drosophila меланогастер'S жизнеспособность от эмбриона к взрослому
Summary
Этот протокол предназначен для оценки жизнеспособности дрозофилы на каждом этапе развития, от эмбриона до взрослого. Метод может быть использован для определения и сравнения жизнеспособности различных генотипов или условий роста.
Abstract
В Drosophila melanogaster, жизнеспособность анализы используются для определения пригодности определенных генетических фонов. Аллельные вариации могут привести к частичной или полной потере жизнеспособности на разных стадиях развития. Наша лаборатория разработала метод оценки жизнеспособности дрозофилы от эмбриона до полностью зрелого взрослого. Метод опирается на количественную оценку количества потомства, присутствующее на различных стадиях развития, начиная с вылупившихся эмбрионов. После того, как эмбрионы были количественно, подсчитываются дополнительные этапы, в том числе L1/L2, куски и зрелые взрослые. После того, как все этапы были изучены, статистический анализ, такой как тест чи-квадрат используется, чтобы определить, есть ли существенная разница между начальным числом потомства (зародышевые эмбрионы) и более поздними стадиями, кульминацией которых является наблюдаемое число взрослых, таким образом, отвергая или принимая нулевую гипотезу (что количество вылупившихся эмбрионов будет равно количеству личинок, кусков и взрослых, зарегистрированных на этапах развития). Основным преимуществом этого исследования является его простота и точность, так как он не требует промывки эмбриона, чтобы перевести их в пищевой флакон, избегая потерь от технических ошибок. Хотя описанный здесь протокол непосредственно не исследует личинки L2/L3, для их учета могут быть добавлены дополнительные шаги. Сравнение количества вылупившихся эмбрионов, L1, куски и взрослых может помочь определить, была ли жизнеспособность нарушена во время этапов L2/L3 для дальнейших исследований (использование цветной пищи помогает с визуальной идентификацией личинок). В целом, этот метод может помочь drosophila исследователей и преподавателей определить, когда жизнеспособность скомпрометирована во время жизненного цикла летать. Регулярная оценка запасов с помощью этого асссе может предотвратить накопление вторичных мутаций, которые могут повлиять на фенотип первоначально изолированного мутанта, особенно если оригинальные мутации влияют на фитнес. По этой причине, наша лаборатория поддерживает несколько копий каждого из наших аллелей Dm ime4 и регулярно проверяет чистоту каждого запаса с помощью этого метода в дополнение к другим молекулярным анализам.
Introduction
Продолжительность жизни зависит от генетических и негенетических факторов. В стандартных условиях роста лаборатории при комнатной температуре, наша лаборатория наблюдается значительное изменение пригодности и жизнеспособности между различными Dm ime4 аллели, выращенные в одинаковых условиях(Рисунок 1 и дополнительные цифры). Исследования жизнеспособности часто проводятся для исследования последствий определенной комбинации аллелей или состояния роста в популяционныхгенетических исследованиях1,2,3. Однако детальный анализ жизнеспособности в недополнятируемой группе мутаций трудно найти в научной литературе. Аллель, как правило, помечены как “несущественные”, если исследователь находит несколько человек homozygous для этого аллеля в пищевой флакон, что дома сбалансированный запас5,6. Тем не менее, точные анализы Чи-квадрат, чтобы оценить, являются ли эти гомозиготы возникают при ожидаемых мендельских соотношений не сообщается5,6. Наиболее разрешительной температурой для любого запаса Дрозофилы является комнатная температура (22-23 градусов по Цельсию) и, при соответствующих питательных веществах, жизненный цикл мух дикого типа занимает около двенадцати дней, чтобы завершить7,8. Как продолжительность каждой стадии развития дикого типа Drosophila известно7,8, метод, описанный в настоящем докладе может быть использован для изучения ли штамм Drosophila в стадии исследования подходит на каждом этапе по сравнению с контролем, подходящим для генетического фона. В отличие от исследований, которые сосредоточены на одном конкретном аспекте развития9, этот протокол предоставляет практический способ оценки жизнеспособности на различных стадиях развития.
В нашей лаборатории, этот протокол используется для оценки жизнеспособности запасов, которые являются недостаточными для Drosophila индуктор Meiosis 4 (Dm ime4). Dm ime4 является важным геном10, который кодирует метилтрансферазу РНК с критическими ролями в метаболизме РНК в Дрозофиле и других многоклеточных организмах5,6,10, 11 Год , 12 Лет , 13 Год , 14 Год . Для быстрой оценки новых аллелей Dm ime4, генерируемых через CRISPR/Cas9 (Дополнительныецифры),был проведен конечный вывод о жизнеспособности, который учитывал только потомство взрослого, произведенное в флаконах сбалансированных запасов (рисунок1). Некоторые из используемых запасов были описаны в предыдущих отчетах Dm ime4 5,6. Гомозиговые мутанты появились на субмендельских уровнях, о пределе анализа чи-квадрата(рисунок 1 и дополнительные материалы). Чтобы оценить, были ли эти более низкие, чем ожидалось, цифры были вызваны меньшим количеством закладыванных эмбрионов или меньшим количеством вылупившихся эмбрионов или потерей жизнеспособности в L1/L2 или куколках, мы расширили отслеживание, включив в него количество на каждом из этих стадий развития (Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, и рисунок 9).
Здесь мы описываем метод с использованием диких типов (OreR) мух. Для эмпирического тестирования этого метода для использования с другими генетическими фонами или видами Drosophila, мы рекомендуем использовать OreR в качестве эталона и корректировать временные точки в зависимости от экспериментального организма. Протокол был дополнительно оценен для оценки жизнеспособности потомства, порожденного скрещиванием девственных диких самок с самцами из гетерозиготного запаса мутантов Dm ime4 5,6 (Рисунок4).
Protocol
Representative Results
Discussion
Таким образом, этот метод обеспечивает точную и простую оценку жизнеспособности в Drosophila. Полный протокол занимает около 14 дней. Процедура не требует экспертных технических навыков; однако, надлежащее время, график ежедневных наблюдений, и тщательный перенос агара имеет важное значение для точности и воспроизводимости.
В дополнение к размещению виноградно-агар-диска эмбриона стороне вниз в пищевой флакон, еще одним важным шагом в процедуре является передача агар-диск агар агар ана в пищевой флакон не позднее 48 ч после удаления виноградной агар пластины из эмбриона сбора мини-клетки. Передача агара после 48 ч привела к потере эмбриона и личинок, вероятно, из-за обезвоживания агар-диска. Чтобы подсчитать l2/L3 переходы, пластина должна инкубировать для 72 ч. Если этот этап имеет решающее значение, виноградные агар пластины должны быть налиты толще и влажная камера должна быть использована для предотвращения высыхания. Кресты были установлены в клетках коллекции эмбрионов, которые вмещают 35-мм пластины; однако, эта процедура может быть выполнена с помощью больших клеток коллекции эмбрионов, а также, такие, как тот, который вмещает 60 мм или 100 мм Петри пластин. Пищевые бутылки должны быть достаточно большими, чтобы вместить эти размеры.
Есть шаги, которые могут быть добавлены в этот протокол. Как уже упоминалось выше, L2/L3 переходы являются сложными для количественной оценки на пластинах из-за времени, необходимого и потенциального обезвоживания агара. Кроме того, личинки становятся очень мобильными на поверхности агара, что создает проблему для их точного подсчета. Размещение пластин в холодильнике в течение 30 минут или добавление нескольких капель мягкого анестетика (раствор лидокаина) на поверхности агара до подсчета личинок L2/L3 может помочь замедлить их движения, чтобы посчитать их более точно. Предостережение к этим изменениям является то, что они могут ввести переменные (холодная чувствительность, чувствительность обезболительного) и заставить засомниться результаты жизнеспособности. Даже без этих шагов, с помощью цветной пищи, исследователи могут количественно блуждающих L3s / prepupae, как они оседают на стороне пищевых флаконов, чтобы инициировать освящение. Ограничение мелопков этого метода заключается в том, что он требует, чтобы взрослые, используемые в крестах, чтобы выжить, будучи под анестетом с CO2 для фенотипирования, чтобы создать кресты в клетках коллекции эмбрионов. Dm ime4 гомозиготных мутантных самцов не выздоравливают хорошо и умирают через несколько часов после пробуждения от лечения CO2. Другие методы обездвиживания взрослых для сортировки могут быть изучены, такие как размещение флаконов в холодильнике в течение нескольких минут, а затем передать флаконы дробленый лед, чтобы замедлить движение и сортировать быстро и эффективно.
Помимо сравнения аллельных сильных сторон и их влияния на жизнеспособность, этот метод может быть использован для проверки чувствительности или устойчивости к определенным фармацевтическим соединениям. В отличие от других методов, которые экран соединения токсичности в клеточной культуре15,16,17,18, этот метод использует целые организмы, что делает оценку развития эффекты легче анализировать. В целом, используя этот протокол и изменения в ней, позволит измерить все сторонние сильные стороны, а также влияние факторов окружающей среды и химических соединений на жизнеспособность Дрозофилы, плодовитость, плодовитость, продолжительность жизни и продолжительность цикл развития.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Наша работа финансируется NIH 1R15GM1131-01 в CFH и NIH PA -12-149 TO CFH.
Materials
| Antimold additive | Carolina | ||
| Beaker | Fisher Scentific | S76100J | Beaker |
| Benchmark scientific digital hotplate | The Lab Depot | H3760H | Hot plate |
| Britta-filtered tap water to prepare grape agar and instant fly food | Any tap water filtration system | ||
| CO2 pistol or FlyNap | Carolina | Anesthetic to sort/count adult flies | |
| Dissecting microscope/stereoscope | Amscope | SM-1TSZ-V203 | Dissecting microscope |
| Drosophila culture vials and stoppers | Carolina | 173120 | Food vials for growing Drosophila |
| Embryo collection mini cage | Genesee Scientific | 59-105 | chamber used to gather embryos |
| Erlenmeyer flask | Sigma-Aldrich | 70980 | Erlenmeyer flask |
| Formula 4-24 Instant Drosophila Medium, Blue | Carolina | https://www.carolina.com/drosophila-fruit-fly-genetics/formula-4-24-drosophila-medium-blue/FAM_173210.pr | |
| Grape agar | Genesee Scientific | 47-102 | Media used for agar plates |
| Instant fly flood | Carolina | 173210 | Blue media for food vials |
| Large Petri dish or any clear container to be used as a humid chamber by placing wet paper towels to keep the grape-agar plates moist during incubation/pre and post microscopic observation | |||
| Metal spatula (small) | Carolina | ||
| Microwave | Any | To cook grape agar | |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2901 | Petri dish for grape agar |
| Stir bar | The Lab Depot | 58948-981-EA | Magnetic stir bar |
References
- Hartung, E. W. Some observations on the larval growth rate and viability of two tumor strains of Drosophila melanogaster. Science. 107 (2777), 296-297 (1948).
- Moree, R., King, J. R. Experimental Studies on Relative Viability in Drosophila Melanogaster. Genetics. 46 (12), 1732-1752 (1961).
- Da Costa, M. V. Viability of F1 and F2 generations of crossed Drosophila and Oregon previously adapted to 2 different nutrient media. Comptes rendus de l’Académie des Sciences. 242 (1), 177-180 (1956).
- Garcia-Dorado, A., Caballero, A. The mutational rate of Drosophila viability decline: tinkering with old data. Genome Research. 8 (2), 99-105 (2002).
- Lence, T., et al. m6A modulates neuronal functions and sex determination in Drosophila. Nature. 540 (7632), 304-318 (2016).
- Haussmann, I. U., et al. m(6)A potentiates Sxl alternative pre-mRNA splicing for robust Drosophila sex determination. Nature. 54 (7632), 301-304 (2016).
- Stockwer, H., Gallant, P. Getting started: An overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).
- Hales, K. G., et al. Genetics on the Fly: A Primer on the Drosophila Model System. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- Gardner, M., et al. Genetic Variation for Preadult Viability in Drosophila melanogaster. Evolution. 55 (8), 1609-1620 (2001).
- Hongay, C. F., Orr-Weaver, T. L. Drosophila Inducer of MEiosis 4 (IME4) is required for Notch signaling during oogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14855-14860 (2011).
- Zhong, S., et al. MTA Is an Arabidopsis Messenger RNA Adenosine Methylase and Interacts with a Homolog of a Sex-Specific Splicing Factor. The Plant Cell. 5, 1278-1288 (2008).
- Wang, Y., et al. N6-methyladenosine modification destabilizes developmental regulators in embryonic stem cells. Nature Cell Biology. 16, 191-198 (2014).
- Hsu, P. J., Shi, H., He, C. Epitranscriptomics influence on development and disease. Genome Biology. 18 (197), 1-9 (2017).
- Kan, L., et al. The m6A pathway facilitates sex determination in Drosophila. Nature Communications. 8, 1-16 (2017).
- Senkowski, W., et al. Three-Dimensional Cell Culture-Based Screening Identifies the Anthelmintic Drug Nitazoxanide as a Candidate for Treatment of Colorectal Cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (6), 1504-1516 (2015).
- Ramasamy, S., Bennet, D., Kim, S. Drug and bioactive molecule screening based on a bioelectrical impedance cell culture platform. International Journal of Nanomedicine. 9, 5789-5809 (2014).
- Weltin, A., et al. Cell culture monitoring for drug screening and cancer research: a transparent, microfluidic, multi-sensor microsystem. Lab on a Chip. 14 (1), 138-146 (2014).
- Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
