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Developmental Biology

Eine direkte und einfache Methode zur Beurteilung der Lebensfähigkeit von Drosophila melanogastervom Embryo zum Erwachsenen

Published: August 27, 2019
doi:
10.3791/59996
, ,
1Department of Biology,Clarkson University

Summary

Dieses Protokoll soll die Lebensfähigkeit von Drosophila in jeder Entwicklungsphase vom Embryo bis zum Erwachsenen bewerten. Die Methode kann verwendet werden, um die Lebensfähigkeit verschiedener Genotypen oder Wachstumsbedingungen zu bestimmen und zu vergleichen.

Abstract

In Drosophila melanogasterwerden Lebensfähigkeits-Assays verwendet, um die Tauglichkeit bestimmter genetischer Hintergründe zu bestimmen. Allelische Variationen können zu einem teilweisen oder vollständigen Verlust der Lebensfähigkeit in verschiedenen Entwicklungsstadien führen. Unser Labor hat eine Methode entwickelt, um die Lebensfähigkeit in Drosophila vom Embryo bis zum vollreifen Erwachsenen zu bewerten. Die Methode beruht auf der Quantifizierung der Anzahl der Nachkommen, die in verschiedenen Stadien während der Entwicklung vorhanden sind, beginnend mit geschlüpften Embryonen. Nach der Quantifizierung der Embryonen werden weitere Stadien gezählt, darunter L1/L2, Pupae und reife Erwachsene. Nachdem alle Stadien untersucht wurden, wird eine statistische Analyse wie der Chi-Quadrat-Test verwendet, um festzustellen, ob es einen signifikanten Unterschied zwischen der Ausgangszahl der Nachkommen (geschlüpfte Embryonen) und späteren Stadien gibt, die in der beobachteten Anzahl von Erwachsenen gipfeln. ablehnung oder akzeptiert die Nullhypothese (dass die Anzahl der geschlüpften Embryonen der Anzahl der Larven, Pupas und Erwachsenen entspricht, die während der Entwicklungsstadien aufgezeichnet wurden). Der Hauptvorteil dieses Assays ist seine Einfachheit und Genauigkeit, da es keine Embryospülung erfordert, um sie auf die Lebensmitteldurchstechflasche zu übertragen, wodurch Verluste durch technische Fehler vermieden werden. Obwohl das hier beschriebene Protokoll L2/L3-Larven nicht direkt untersucht, können zusätzliche Schritte hinzugefügt werden, um diese zu berücksichtigen. Vergleichen der Anzahl der geschlüpften Embryonen, L1, Pupae, und Erwachsene können helfen, festzustellen, ob die Lebensfähigkeit während der L2/L3-Stadien für weitere Studien beeinträchtigt wurde (die Verwendung von farbigen Lebensmitteln hilft bei der visuellen Identifizierung von Larven). Insgesamt, Diese Methode kann Drosophila Forscher und Pädagogen bestimmen, wann die Lebensfähigkeit während des Fliegenlebenszyklus beeinträchtigt wird. Die routinemäßige Bewertung von Beständen mit diesem Test kann die Anhäufung von sekundären Mutationen verhindern, die den Phänotyp des ursprünglich isolierten Mutanten beeinflussen können, insbesondere wenn die ursprünglichen Mutationen die Fitness beeinträchtigen. Aus diesem Grund unterhält unser Labor mehrere Kopien jedes unserer Dm ime4-Allele und überprüft routinemäßig die Reinheit jedes Bestands mit dieser Methode zusätzlich zu anderen molekularen Analysen.

Introduction

Die Lebensdauer wird durch genetische und nicht-genetische Faktoren beeinflusst. In Standard-Laborwachstumsbedingungen bei Raumtemperatur hat unser Labor signifikante Variationen von Fitness und Lebensfähigkeit zwischen verschiedenen Dm ime4-Allelen beobachtet, die unter identischen Bedingungen angebaut werden (Abbildung 1 und Zusatzabbildungen). Viability-Studien werden häufig durchgeführt, um die Auswirkungen einer bestimmten Allel-Kombination oder Wachstumszustand in DerpopulationsgenetischeStudien1,2,3,4zu untersuchen. Detaillierte Analysen der Lebensfähigkeit innerhalb einer nicht komplementären Gruppe von Mutationen sind jedoch in der wissenschaftlichen Literatur schwer zu finden. Ein Allel wird in der Regel als “nicht-essentiell” bezeichnet, wenn der Forscher ein paar Individuen homozygot für das Allel in der Lebensmitteldurchstechflasche findet, die den ausgewogenen Vorrat5,6beherbergt. Genaue Chi-Quadrat-Analysen, um zu beurteilen, ob diese Homozygoten bei den erwarteten Mendelian-Verhältnissen entstehen, werden jedoch nicht5,6gemeldet. Die freizügigste Temperatur für jeden Drosophila-Bestand ist die Raumtemperatur (22-23 °C) und bei entsprechenden Nährstoffendauert der Lebenszyklus von Wildfliegen etwa zwölf Tage, um 7,8zu vollenden. Da die Dauer jeder Entwicklungsstufe der Wildtyp-Drosophila7,8bekannt ist, kann die in diesem Bericht beschriebene Methode verwendet werden, um zu untersuchen, ob der untersuchte Drosophila-Stamm in jedem Stadium fit ist. im Vergleich zu einer Kontrolle, die für den getesteten genetischen Hintergrund geeignet ist. Im Gegensatz zu Studien, die sich auf einen spezifischen Aspekt der Entwicklungkonzentrieren 9, bietet dieses Protokoll eine praktische Möglichkeit, die Lebensfähigkeit in verschiedenen Entwicklungsstadien zu bewerten.

In unserem Labor wird dieses Protokoll verwendet, um die Lebensfähigkeit von Beständen zu bewerten, die für Drosophila Induktor von Meiose 4 (Dm ime4) mangelhaft sind. Dm ime4 ist ein essentielles Gen10, das eine RNA-Methyltransferase mit kritischen Rollen im RNA-Stoffwechsel in Drosophila und anderen mehrzelligen Organismen 5,6,10, 11 , 12 , 13 , 14 . Um neuartige Allele von Dm ime4, die über CRISPR/Cas9 (Supplemental Figures) erzeugt wurden, schnell zu bewerten, wurde ein Endpunkt-Lebensfähigkeitstest durchgeführt, der nur erwachsene Nachkommen zählte, die in Durchstechflaschen mit ausgewogenen Beständen erzeugt wurden (Abbildung 1). Einige der verwendeten Bestände wurden in früheren Dm ime4-Berichten 5,6beschrieben. Homozygote Mutanten entstanden auf submendelianischer Ebene, bestimmt durch Chi-Quadrat-Analysen (Abbildung 1 und ergänzende Materialien). Um zu beurteilen, ob diese niedriger als erwarteten Zahlen auf weniger embryosals oder weniger geschlüpfte Embryonen oder den Verlust der Lebensfähigkeit in L1/L2 oder Pupas zurückzuführen sind, haben wir die Verfolgung um Zählungen in jeder dieser Entwicklungsstadien erweitert (Abbildung2, Abbildung 3, Abbildung 4, Abbildung 5, Abbildung 6, Abbildung 7, Abbildung 8und Abbildung 9).

Hier beschreiben wir die Methode mit Wildtyp (OreR) Fliegen. Um diese Methode empirisch für die Verwendung mit anderen genetischen Hintergründen oder Drosophila-Arten zu testen, empfehlen wir die Verwendung von OreR als Referenz und Anpassung der Zeitpunkte an den Versuchsorganismus.  Das Protokoll wurde weiter ausgewertet, um die Lebensfähigkeit der Nachkommen zu bewerten, die durch Kreuzung von jungfräulichen Wildtypweibchen mit Männchen aus einem heterozygoten Dm ime4 Mutantenbestand5,6 ( Abbildung4) erzeugt werden.

Protocol

1. Medienvorbereitung Traubenagar nach Herstelleranleitung zubereiten (siehe Materialtabelle) und in eine 35 mm Petrischale halbvoll gießen (Abbildung 5).  Etwa 1 h erstarren lassen. Nach der Vererbgung des Traubenagars sofort bei 4 °C verwenden oder lagern. Machen Sie vorsichtig Kratzer über die Agarplatte mit einem kleinen Plastikmesser (Fliegen wie auf unebenen Oberflächen liegen), so dass die Mitte der Platte ohne Kratzer (Abbildung5). Legen Sie eine kleine Menge Hefepaste (frisch gemacht; siehe Tabelle der Materialien) in der Mitte der Platte ( Abbildung5). 2. Embryo Collection Mini Käfig einrichten Richten Sie ein Kreuz mit zwei jungfräulichen Weibchen und einem jungen Männchen im Embryo-Sammelkäfig ein, das die mit Hefepaste ergänzte Traubenagarplatte enthält (Abbildung 5). Nach 24 h die Käfige auf gelegte Embryonen untersuchen, ohne den Käfig zu öffnen, indem Sie auf den Boden der Agarplatte schauen.  Wenn Embryonen verlegt wurden, entfernen Sie die Agarplatte aus der Kammer und legen Sie sie in eine feuchte Kammer für die mikroskopische Beobachtung (Abbildung6).  Wenn mehrere Tage der Verlegung bewertet werden (z.B. Fruchtbarkeit/Lebensdauer-Assays), halten Sie die Zuchteltern und ersetzen Sie den Teller durch einen frischen, wie beschrieben zubereitet. Frühe Sammlungen von weniger als 24 h können durchgeführt werden, aber, wenn Sie jungfräuliche Weibchen verwenden, beachten Sie, dass sie nicht bis 48 h nach dem Auftauchen aus ihrem Pupa-Fall liegen werden. Bedecken Sie die Agarplatte mit Embryonen mit dem Petrischalendeckel, um Eine Austrocknung zu vermeiden, und legen Sie sie sofort in eine feuchte Kammer (Abbildung 7). Beobachten Sie unter einem Sezieren Mikroskop und zeichnen Sie geschlüpfte Embryonen und L1 auf.  Deckel ersetzen und bei Raumtemperatur in feuchter Kammer lagern, bis alle Embryonen geschlüpft sind und sich zu L1-Larven entwickelt haben (Abbildung 6). 3. Zählen von Embryonen und Larven Nach 48 h die Platten unter dem Sezieren des Mikroskops beobachten und die Zahlen ein letztes Mal aufzeichnen, bevor sie die Agarscheibe in die Lebensmittelflasche überführt.  Befruchtete/lebensfähige Embryonen sollten bis dahin Zul1 werden.  Längere Inkubationszeiten vor dem Transfer sind möglich, aber seien Sie sich bewusst, dass Platten beginnen können, Feuchtigkeit zu verlieren und der Agar kann knacken, was einen sauberen Transfer zu Lebensmittelfläschchen beeinträchtigt (Abbildung 7).  Um sicherzustellen, dass die Platten hydratisiert bleiben und die Lebensfähigkeit des Embryos beim Zählen nicht beeinträchtigt wird, vermeiden Sie die Verwendung eines direkten Schwanenhalslichts über der Agaroberfläche (Abbildung7E zeigt einen angemessenen Abstand). Nach dem Zählen die Platte bedecken und in der feuchten Kammer aufbewahren, bis sie überwiesen werden kann. Aufzeichnung von Ergebnissen. 4. Übertragen Sie die Grape Agar Disc in eine Lebensmittelflasche, um die Lebensfähigkeit während der Entwicklung zu überwachen Sobald die Zahlen aufgezeichnet sind (schraffierte Embryonen/L1/L2), verwenden Sie einen Spachtel, um die Agarscheibe sorgfältig in eine Durchstechflasche zu übertragen, die groß genug ist, um eine 35-mm-Scheibe aufzunehmen, die Drosophila-Lebensmittelmedien enthält, die gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt wurden (siehe Liste der Reagenzien). Legen Sie die Trauben-Agar-Scheibe L1-Seite nach unten auf das Essen (Abbildung 7).  Nach dem Transfer der Agarscheibe mit Larven in die Nahrungsflasche, überprüfen Sie sorgfältig die leere Petrischale auf alle zurückgelassenen Larven (Abbildung 7E). Richten Sie einen Zeitplan ein, um Lebensmittelfläschchen täglich zu etwa zur gleichen Zeit jeden Tag zu inspizieren, um sicherzustellen, dass L2/L3-Larven beobachtet werden, die ihren Weg zum Essen in der Durchstechflasche machen (Abbildung 8). Notieren Sie die Anzahl der Pupae und erwachsenen Drosophila (Abbildung 9). Halten Sie die Zählung, bis keine Erwachsenen mehr beobachtet werden und vermeiden Sie es, die folgende Generation zu zählen (zählen Sie nicht nach 9 Tagen nach der Beobachtung der ersten Erwachsenen). Beobachten und erfassen Sie die Ergebnisse. Passen Sie den Zeitrahmen der Embryoentnahme, -zählung und -aufzeichnung entsprechend an den verwendeten mutierten Bestand an. Führen Sie eine Chi-Quadrat-Analyse durch. Die Nullhypothese geht von einer 100%igen Lebensfähigkeit aus, so dass die Anzahl der Erwachsenen der Anzahl der ursprünglich aufgezeichneten und auf die Nahrungsfläschchen übertragenen Embryonen entspricht.

Representative Results

Diese Methode ermöglicht es, die Lebensfähigkeit von Embryonen bis zu erwachsenen Erwachsenen genau und reproduzierbar zu messen, wenn sie an Chi-Quadrat-Analysen gekoppelt sind. In ersten Studien wurde der Traubenagar nach dem Zählen von Embryonen und Larven aufrecht auf der Seite der Durchstechflasche in die Durchstechflasche gelegt. Leider, wenn der Agar auf der Seite der Durchstechflasche platziert wurde, reiften viele der Embryonen und Larven nicht zu Erwachsenen. Dies war wahrscheinlich auf das Austrocknen der Trauben-Agar-Scheibe zurückzuführen (Abbildung3). Diese Platzierung führte eine Umgebungsvariable (Hydratation der Agarscheibe) ein, die die Ergebnisse verwirren konnte. Ungefähr 39 % der Nachkommen gingen zwischen Embryonen an Erwachsene verloren, da nur 61 % der Erwachsenen auftraten. Die größten Verluste entstanden zwischen den L1-Larven (auf der Oberfläche von Traubenagarplatten gezählt) und Pupae (auf wänden von Futterfläschchen gezählt) zählt. Wenn der Traubenagar jedoch in direktem Kontakt mit der Nahrungsoberfläche in die Durchstechflasche gelegt wurde, gingen weniger als 6 % der Nachkommen verloren (Abbildung 2). Der Agar blieb hydratisiert, da die gesamte Trauben-Agar-Scheibe in Kontakt mit der Feuchtigkeit der Instant-Nahrung in der Durchstechflasche blieb (Abbildung 7, Abbildung 8). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Position des Agars in der Durchstechflasche wichtig ist, um zuverlässige Daten zu erhalten und den Beitrag von Umweltvariablen zu minimieren. Weitere Daten zur Unterstützung der Wirksamkeit der Methode wurden durch den Vergleich der Wildtyp-Nachkommen, die bei der anfänglichen Methodenvalidierung und Der Nachkommenbildung verwendet wurden, durch Kreuzung von jungfräulichen Wildtypweibchen zu Männchen aus einem ausgewogenen Dm ime4-Mutantenbestand ( Ergänzende Abbildung 2, ime4-null/TM3sb). Ungefähr 91% der Nachkommen reiften bis zum Erwachsenenalter im Vergleich zu 94% der Nachkommen von Wildtyp (Abbildung 4).  Dieser Unterschied war statistisch nicht signifikant. Homozygot dm ime4 mutierte Männchen5 wurden auch verwendet, um eine weitere Validierung der Methode zu bieten. Die homozygoten Mutanten waren jedoch zu krank, um sich zu vermehren, und starben, bevor Embryonen abgelagert wurden. Daher ist eine Einschränkung des Experiments, dass Männchen gesund genug sein müssen, um sich zu vermehren, um eine beginnende Embryopopulation zu erzeugen, um sie zu verfolgen. Abbildung 1 : Dm ime4 mutierte Bestände entstehen auf submendelianischem Niveau. Es werden Bestände angezeigt, in denen Teile der katalytischen Domäne oder der Ado-Met-Bindungsdomäne mutiert wurden (Details siehe Ergänzende Abbildung 1). Einige Bestände hatten Teile einer der beiden Domains durch Ala (Alanin-Scanning Mutagenese) ersetzt, während andere Bestände entweder oder beide Domänen gelöscht wurden. Das Verhältnis der beobachteten Anzahl der Homozygoten zu den erwarteten Zahlen wird in Prozenten dargestellt (im Vergleich zu heterozygoten Geschwisterkontrollen siehe Ergänzende Abbildung 3 für Sortierschema und Chi-Quadrat-Analyse). Chi-Quadrat-Analysen wurden durchgeführt, um festzustellen, ob die Differenz zwischen beobachtet und erwartet statistisch signifikant war und nicht allein aufgrund des Zufalls (p-Werte < 0,01). Fehlerbalken stellen einen Standardfehler des Mittelwerts dar (mindestens drei Versuche pro angegebenem Kreuz).  Eine Kalkulationstabelle mit allen Daten finden Sie in Supplemental Materials. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2 : Die Agar-Position innerhalb der Durchstechflasche kann unbeabsichtigte Umweltvariablen einführen. Histogramm der Anzahl der Individuen in verschiedenen Entwicklungsstadien von Trauben-Agar-Scheibe-Embryo-Seite nach unten in Lebensmittel-Fläschigkeit oder Agar auf der Seite der Lebensmittel-Durchstechflasche gezählt. Das Platzieren der Agarscheibe embryo-seite in der Durchstechflasche führte zu 94% (SD – 0,02) der ersten Embryonen, die bis ins Erwachsenenalter überlebten. Das Platzieren des Agars auf der Seite der Durchstechflasche führte dazu, dass nur 61% (SD – 0,07) der ursprünglich gezählten Embryonen das Erwachsenenalter erreichten. Eine Kalkulationstabelle mit allen Daten finden Sie in den Ergänzungsmaterialien. Die erwarteten Zahlen in jedem Stadium werden festgelegt, da die anfängliche Anzahl der Embryonen/L1 auf der Trauben-Agar-Scheibe vor der Übertragung auf die Nahrungsdurchstechsons gezählt wird (Nullhypothese: 100% der geschlüpften Embryonen entwickeln sich). Die beobachteten Zahlen sind die tatsächliche Anzahl der Personen, die für die angegebene Entwicklungsphase gezählt wurden. So wird jedes Stadium mit der anfänglichen Anzahl von geschlüpften Embryonen verglichen, die auf dem Traubenagarteller gezählt werden. Chi-Quadrat-Analysen wurden durchgeführt, um festzustellen, ob die Differenz zwischen beobachtet und erwartet statistisch signifikant war und nicht allein durch Zufall mit einem p-Wert-Schwellenwert von 0,05. Der Unterschied war signifikant für Embryonen, die mit Agar an der Seite der Durchstechflasche angebaut wurden, aber nicht für Embryonen, die in einer Scheiben-Embryo-Seite nach unten angebaut wurden. Fehlerbalken stellen Standardfehler dar (mindestens drei Versuche pro angegebenem Kreuz). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3 : Cartoon, das zwei Möglichkeiten zeigt, wie Traubenagarscheiben, die Embryonen/L1s tragen, in die Durchstechflasche der Nahrung gelegt werden können. Es gab einen signifikanten Unterschied zwischen der Gesamtzahl der Embryonen und der erwachsenen Nachkommenschaft basierend auf der Position des Agars in der Nahrungsdurchstechflasche. Der Unterschied ergibt sich aus einer Umweltvariablen (Hydratation), die durch den Unterschied in der Scheibenplatzierung in der Lebensmitteldurchstechflasche entsteht: Es gibt einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen erwarteten und beobachteten Zahlen in den Larven und Denphasen, wenn der Agar zählt, wenn der Agar Disc wurde auf der Seite der Durchstechflasche platziert, im Gegensatz zu keinem signifikanten Unterschied in den erwarteten zahlen im Vergleich zu den beobachteten Zahlen, wenn die Agarscheibe in Kontakt mit dem Lebensmittel war. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4 : Histogramm zeigt die Anzahl der Individuen in verschiedenen Entwicklungsstadien von WildtypMännchen im Vergleich zu Männchen aus einem Dm ime4 mutierten ausgeglichenen Bestand. Ausgewogene Männchen kreuzten sich zu jungfräulichen Wildtypweibchen, wie in 2.1 beschrieben.  Agar wurde embryonal in Nahrungsfläschchen übertragen.  Das durchschnittliche Verhältnis der Erwachsenen, die aus den ursprünglichen Embryonen hervorgehen, die in Trauben-Agar-Scheiben vom Wildtyp X-Wildtyp gezählt wurden, betrug 94 %, SD 0,02, während dieses Verhältnis für Dm ime4 Mutant/+ X Wildtyp 91 %, SD 0,01 betrug. Die statistische Analyse wurde wie in Abbildung 2beschrieben durchgeführt; Unterschiede waren für beide Gruppen nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5 : Experimentelle Einrichtung. (A) Embryo-Kollektion Mini-Käfige und Trauben-Agar-Mini-Petri-Gerichte. Die Platten werden in einer feuchten Kammer (Standard Petrischale mit saugfähiger, mit Wasser gesättigter Papierscheibe) platziert, um Austrocknung zu verhindern.  Eine kleine Menge Hefepaste wurde in der Mitte jedes Trauben-Agar-Tellers platziert.  (B) Lösen Sie den Deckel des Embryo-Entnahmeplattenhalters (rot) und legen Sie eine vorbereitete Platte, Hefeseite nach oben.  (C) Übertragen Sie das Kreuz in den Embryokäfig und legen Sie sofort einen Petrischalendeckel auf, um Fliegen im Inneren zu halten.  (D) Entfernen Sie schnell Abdeckung und kippen Sie den Embryo-Käfig so Öffnung Kontakte Trauben-Agar-Platte.  Inkubieren für 24-48 h, Inspektion täglich. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 6 : Embryoentwicklung auf Trauben-Agar-Platten. (A) Wildtyp-Embryonen, die auf den Mini-Petri-Schalen der Trauben-Agar abgelagert werden, werden unter einem Seziermikroskop gezählt. Halten Sie Platten in feuchter Kammer, wenn Sie nicht visualisieren und vermeiden Sie direktes Licht, um Austrocknung zu verhindern.  (B) Trauben-Agar-Platten werden in einer feuchten Kammer aufbewahrt und geschlüpfte Wildtyp-Embryonen werden aufgezeichnet.  Dieses Foto zeigt drei Wildtyp-L1-Larven, die sich aus Embryonen entwickelten, die in A gezeigt wurden.  (C) Beispiel für die aufgezeichnete Anzahl von Embryonen (Tag 1) und L1-Larven (Tag 2) für die beiden in Abbildung 5dargestellten Platten.  Die “erwartete Zahl” für die Nullhypothese wird durch die Anzahl der Embryonen bestimmt, die zum Zeitpunkt der Übertragung in die Nahrungsdurchstechsons schlüpften und zu L1-Larven wurden (Tabelle unten).  Bei Wildtypfliegen schlüpfen fast alle Embryonen und entwickeln sich zu L1-Larven.  Dies ist möglicherweise nicht der Fall für andere genetische Hintergründe und diese Methode wird verwendet, um diese Unterschiede in der Lebensfähigkeit zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 7 : Übertragen von Larven.  (A) Nach der Aufzeichnung l1 zählt, werden die Trauben-Agar-Scheiben sorgfältig aus der Petrischale mit einem sauberen (Ethanol-gewischten) Spachtel (B,C) entfernt und L1 seitlich übertragen, um das Futter in den Fläschchen zu kontaktieren, wie in Dgezeigt.  (E) Die leere Petrischale wird sorgfältig untersucht, um zurückgelassene Larven zu erkennen.  Wenn zurückgelassene Larven am Leben sind und auf die Nahrungsdurchstechflasche übertragen werden können, tun Sie dies sorgfältig und sofort (F).  Wenn zurückgelassene Larven tot sind oder nicht übertragen werden können, notieren Sie diese Tatsache, um die “erwartete Zahl” für nachfolgende Berechnungen zu korrigieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 8 : L2-Larven finden ihren Weg in die Nahrung. Sehen Sie Spalten und Rillen zwischen der Trauben-Agar-Scheibe und dem blauen Essen.  Richten Sie einen Zeitplan ein, um die Fläschchen täglich zu beobachten, vorzugsweise zur gleichen Tageszeit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 9 : Erwachsenenbildung. (A) L3-Larven machen sich aus dem Futter zu Welpen.  (B) Erwachsene beginnen am 11. Tag aufzutauchen.  Richten Sie einen Zeitplan ein, um die Fläschchen täglich zu beobachten, vorzugsweise zur gleichen Tageszeit, und zeichnen Sie Ihre Beobachtungen sorgfältig auf.  Hören Sie auf zu zählen, wenn alle Pupas aufgetaucht sind (zählen Sie leere Welpenfälle) und vermeiden Sie es, die nächste Generation von Fliegen zu zählen, indem Sie das Experiment am 15. Tag abbrechen und zählen Sie tote Welpen, falls vorhanden (schwarze/getrocknete Pupas).  Mutanten mit längeren Lebenszyklen können längere Zeiträume benötigen, die empirisch bestimmt werden müssen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Ergänzende Figuren. Bitte klicken Sie hier, um diese Dateien herunterzuladen.   Ergänzende Materialien. Bitte klicken Sie hier, um diese Dateien herunterzuladen.  

Discussion

Zusammenfassend bietet diese Methode eine genaue und einfache Bewertung der Lebensfähigkeit in Drosophila. Das gesamte Protokoll dauert ca. 14 Tage. Das Verfahren erfordert keine fachkundigen Fachkenntnisse; Das richtige Timing, ein Zeitplan für tägliche Beobachtungen und die sorgfältige Agar-Übertragung sind jedoch wichtig für die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit.

Neben der Platzierung der Trauben-Agar-Scheibe-Embryoseite in der Futterdurchstechflasche ist ein weiterer entscheidender Schritt im Verfahren die Übertragung der Agarscheibe auf eine Lebensmitteldurchstechflasche spätestens 48 h, nachdem der Trauben-Agar-Teller aus den Minikäfigen der Embryosammlung entfernt wurde. Die Übertragung des Agars nach 48 h führte zu einem Verlust von Embryonen und Larven, wahrscheinlich aufgrund der Dehydrierung der Agarscheibe. Um L2/L3-Übergänge zu zählen, muss die Platte für 72 h inkubiert werden. Wenn diese Phase entscheidend ist, sollten Traubenagarplatten dicker gegossen werden und eine feuchte Kammer muss verwendet werden, um ausweichend zu verhindern. Die Kreuze wurden in Embryo-Sammelkäfigen aufgestellt, die 35-mm-Platten aufnehmen; Dieses Verfahren kann jedoch auch mit größeren Embryo-Entnahmekäfigen durchgeführt werden, z. B. mit 60 mm oder 100 mm Petriplatten.  Lebensmittelflaschen müssen dann groß genug sein, um diese Größen unterzubringen.

Es gibt Schritte, die diesem Protokoll hinzugefügt werden können. Wie bereits erwähnt, sind L2/L3-Übergänge aufgrund der benötigten Zeit und der möglichen Austrocknung des Agars schwierig, auf Platten zu quantifizieren. Darüber hinaus werden Larven auf der Oberfläche des Agars hochbeweglich, was eine Herausforderung darstellt, sie genau zu zählen. Das Platzieren der Teller im Kühlschrank für 30 min oder das Hinzufügen von ein paar Tropfen eines milden Anästhetikums (Lidocain-Lösung) auf der Oberfläche des Agars vor dem Zählen von L2/L3-Larven kann helfen, ihre Bewegungen zu verlangsamen, um sie genauer zu zählen.  Ein Vorbehalt zu diesen Modifikationen ist, dass sie Variablen einführen können (Kälteempfindlichkeit, Anästhesieempfindlichkeit) und die Rentabilitätsergebnisse verwirren können.  Auch ohne diese Schritte können Forscher durch die Verwendung von farbigen Lebensmitteln wandernde L3s/Prepupae quantifizieren, während sie sich auf der Seite der Nahrungsfläschchen niederlassen, um Die Verpuupation zu initiieren. Eine Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass die erwachsenen Kinder, die in den Kreuzen verwendet werden, die Anästhesie mit CO2 für Diephänotypisierung überleben müssen, um die Kreuze in den Embryo-Sammelkäfigen einzurichten. Dm ime4 homozygote mutierte Männchen erholen sich nicht gut und sterben ein paar Stunden nach dem Aufwachen von CO2 Behandlung.  Andere Methoden zur Immobilisierung von Erwachsenen zum Sortieren können erforscht werden, wie z. B. das Aufstellen von Fläschchen im Kühlschrank für ein paar Minuten und dann das Übertragen von Fläschchen auf zerkleinertes Eis, um die Bewegung zu verlangsamen und schnell und effizient zu sortieren.

Neben dem Vergleich der allelischen Stärken und ihrer Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit kann dieses Verfahren verwendet werden, um die Empfindlichkeit oder Resistenz gegenüber definierten pharmazeutischen Verbindungen abzuschirmen. Im Gegensatz zu anderen Methoden, die die toxizitätscompound in der Zellkultur15,16,17,18, screenen, verwendet diese Methode ganze Organismen, was die Bewertung von Entwicklungseffekten leichter zu analysieren macht. Zusammenfassend lässt sich die Verwendung dieses Protokolls und der darin enthaltenen Änderungen die Allylstärken sowie die Auswirkungen von Umweltfaktoren und chemischen Verbindungen auf die Drosophila-Lebensfähigkeit, Fruchtbarkeit, Fruchtbarkeit, Lebensdauer und Dauer der Entwicklungszyklus.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Unsere Arbeit wird von NIH 1R15GM1131-01 an CFH und NIH PA -12-149 TO CFH finanziert.

Materials

Antimold additive Carolina
Beaker Fisher Scentific S76100J Beaker
Benchmark scientific digital hotplate The Lab Depot H3760H Hot plate
Britta-filtered tap water to prepare grape agar and instant fly food Any tap water filtration system
CO2 pistol or FlyNap Carolina Anesthetic to sort/count adult flies
Dissecting microscope/stereoscope Amscope SM-1TSZ-V203 Dissecting microscope
Drosophila culture vials and stoppers Carolina 173120 Food vials for growing Drosophila
Embryo collection mini cage Genesee Scientific 59-105 chamber used to gather embryos
Erlenmeyer flask Sigma-Aldrich 70980 Erlenmeyer flask
Formula 4-24 Instant Drosophila Medium, Blue Carolina https://www.carolina.com/drosophila-fruit-fly-genetics/formula-4-24-drosophila-medium-blue/FAM_173210.pr
Grape agar Genesee Scientific 47-102 Media used for agar plates
Instant fly flood Carolina 173210 Blue media for food vials
Large Petri dish or any clear container to be used as a humid chamber by placing wet paper towels to keep the grape-agar plates moist during incubation/pre and post microscopic observation
Metal spatula (small) Carolina
Microwave Any To cook grape agar
Petri dish Kord-Valmark 2901 Petri dish for grape agar
Stir bar The Lab Depot 58948-981-EA Magnetic stir bar
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References

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Drosophila MelanogasterViability AssayEmbryo To AdultSimplicityAccuracyGrape AgarYeast PasteEmbryo CollectionHatched EmbryosL1 LarvaeL2 LarvaeL3 LarvaePupaeAdult DrosophilaChi-square AnalysisNull Hypothesis

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Rockwell, A. L., Beaver, I., Hongay, C. F. A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster‘s Viability from Embryo to Adult. J. Vis. Exp. (150), e59996, doi:10.3791/59996 (2019).
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