ショウジョウバエメラノガスターの胚から成人への生存率を評価する直接的かつ簡単な方法

この方法は、正確かつ再現可能に、チク正方形分析に結合した場合、胚から出現した成人までの生存率を測定することができます。 最初の研究では、胚と幼虫を数えた後、ブドウ寒天はバイアルの側面に直立したバイアルの内側に置かれた。残念ながら、寒天がバイアルの側に置かれたとき、胚と幼虫の多くは成人に成熟しなかった。これは、ブドウ寒天ディスクが乾燥したためである可能性が高い(図3)。この配置は、結果を混乱させる可能性のある環境変数(寒天ディスクの水和)を導入しました。子孫の約39%は、成人のわずか61%が出現したので、胚から成人までの間で失われました。最大の損失は、L1幼虫(ブドウ寒天プレートの表面にカウントされる)と子犬(食物バイアルの壁にカウントされる)カウントの間に発生しました。しかし、ブドウ寒天を食品表面に直接接触してバイアルの内側に下向きに置くと、子孫の6%未満が失われました(図2)。ブドウ寒天ディスク全体がバイアル内のインスタント食品の水分と接触したままであったので、寒天は水分補給されたままでした(図7、図8)。これらの結果は、バイアル内の寒天の位置が信頼できるデータを得て、環境変数の寄与を最小限に抑えるために重要であることを示しています。この方法の有効性を支持するさらなるデータは、初期法の検証で使用される野生型の子孫と、バランスのとれたDm ime4変異株から男性に対してバージン野生型の雌を交渡することによって生成される子孫を比較することによって収集された(補足図2, ime4Δnull/TM3sb)野生型由来の子孫の94%に比べて成人期に成熟した子孫の約91%(図4)。 この差は統計的に有意ではなかった。 ホモ接済性Dm ime4変異雄5も、この方法のさらなる検証を提供するために用いた。しかし、ホモ接性変異体は、胚が沈着する前に繁殖し、死ぬには病気だった。したがって、実験の1つの制限は、男性が追跡する開始胚集団を生成するのに十分な健康である必要があることです。 図 1: Dm ime4変異株は、サブメンデリアンレベルで出現します。触媒ドメインまたはAdo-Met結合ドメインの一部が変異した株式を示す(詳細は補足図1を参照)。一部の株式は、どちらかのドメインの一部を Ala (アラニンスキャン変異)に置き換え、他の株式はどちらかまたは両方のドメインを削除しました。観察されたホモ接合数の数と予想される数の比率はパーセンテージで表されます(ヘテロ接合兄弟対照と比較して、ソートスキームとカイ二乗分析の補足図3を参照)。カイ二乗分析は、観測値と期待値の差が統計的に有意であり、偶然によるものではないかどうかを判断するために行われました(p値< 0.01)。誤差余数は、平均値の標準誤差を表します(クロスごとに最低3回の試行)。 すべてのデータを含むスプレッドシートは、補足資料で見つけることができます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 2: バイアル内部の寒天位置は、意図しない環境変数を導入する可能性があります。発達の異なる段階における個体数のヒストグラムは、ブドウ寒天椎胚側から食物バイアルまたは食物バイアルの側の寒天にカウントされた。寒天ディスク胚側をバイアルに置くことは、成人になるまで生存する初期胚の94%(SD±0.02)をもたらした。食物バイアルの側面に寒天を置くと、もともと数えられた胚の61%(SD±0.07)しか成人期に達し得た。すべてのデータを含むスプレッドシートは、補足資料で見つけることができます。各段階での期待される数は、食物バイアルに移る前にブドウ寒天ディスクにカウントされた胚/L1の初期数として設定される(帰無仮説:孵化胚の100%が発症する)。観察された数は、示された発達段階でカウントされた実際の個体数です。したがって、各段階は、ブドウ寒天プレート上にカウントされた孵化胚の初期数と比較される。カイ二乗分析は、観測値と予想値の差が統計的に有意であり、p値しきい値0.05を使用した単独での偶然によるものではないかどうかを判断するために行われました。この差は、食物バイアルの側に寒天で成長した胚では有意であったが、椎間板胚側で成長した胚には有意ではなかった。誤差バーは標準誤差を表します(クロスごとに最低3回の試行が示されます)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 3:胚/L1を運ぶブドウ寒天ディスクを食品バイアル内に配置することができる2つの方法を示す漫画。食物バイアル中の寒天の位置に基づいて、胚の総数と成人子孫の間に有意な差があった。この違いは、食物バイアル内のディスク配置の違いによって生じる環境変数(水和)に起因する:寒天の場合、幼虫と子犬の予想数と観察数の間に統計的に有意な差がある。円盤は、寒天ディスクが食物と接触した場合に、予想数と観測数に有意な差が生じなかったのに対して、バイアルの側面に配置された。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 4: Dm ime4変異体バランスストックからの野生型男性と男性の発達の異なる段階における個体数を示すヒストグラム。バランスの取れた雄は、2.1に記載されているように、処女野生型の女性に渡った。 寒天は胚側を食物バイアルに移した。 野生型X野生型のブドウ寒天椎間でカウントされた元胚から出現した成人の平均比率は94%、SD±0.02、Dm ime4変異体/+X野生型の割合は91%、SD±0.01であった。統計分析は、図 2に記載されているように実行されました。いずれのグループにおいても相違は大きくなかった。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 5: 実験的なセットアップ。(A) 胚コレクションミニケージとブドウ寒天ミニペトリ料理。プレートは、脱水を防ぐために湿気のあるチャンバー(水で飽和吸収性紙ディスク付きの標準的なペトリ皿)の中に配置されます。 各ブドウ寒天プレートの中央に少量の酵母ペーストを配置しました。 (B)胚採取板ホルダー蓋(赤色)を取り外し、調製プレートを上に置き、酵母側を上に置く。 (C) 十字架を胚ケージに移し、すぐにペトリ皿の蓋を置いてハエを中に入れます。 (D) カバーを素早く取り外し、胚ケージをひっくり返して、ブドウ寒天プレートに接触させます。 24-48時間インキュベートし、毎日検査します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 6: ブドウ寒天プレート上の胚発生(A)ブドウ寒天ミニペトリ皿に堆積した野生型胚は、解剖顕微鏡下で数えられる。可視化しない場合は湿気の多い室内にプレートを保管し、脱水を防ぐために直接光を避けてください。 (B)ブドウ寒天プレートは湿気のある室内に保管され、孵化した野生型胚が記録される。 この写真は、Aに示す胚から発達した3匹の野生型L1幼虫を示しています。 (C)図5に示す2つのプレートについて、記録された胚数(1日目)及びL1幼虫(2日目)の例。 帰無仮説の「期待数」は、食物バイアルへの移植時に孵化してL1幼虫となった胚の数によって決定される(下図)。 野生型のハエの場合、ほとんどすべての胚が孵化し、L1幼虫に成長する。 これは、他の遺伝的背景の場合はそうではない可能性があり、この方法は、生存率のこれらの違いを決定するために使用されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 7: 幼虫を移送する。 (A) L1カウントを記録した後、ブドウ寒天ディスクは、クリーン(エタノール拭き)へらを用いてペトリ皿から慎重に除去し、L1サイドダウンしてDに示すようにバイアル内の食品に接触させる。 (E) 空のペトリ皿は、残された幼虫を検出するために慎重に検査されます。 残された幼虫が生きていて、食物バイアルに移すことができる場合は、慎重かつ直ちに行います(F)。 残された幼虫が死んでいるか、転送できない場合は、この事実を記録して、後続の計算のために「期待される数」を修正します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 8:L2幼虫は食べ物に自分の道を作る.ブドウ寒天ディスクと青い食べ物の間の隙間と溝を参照してください。 バイアルを毎日観察するスケジュールを設定します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 9:大人登場。(A) L3幼虫は、子犬になるために食べ物から出て行く。 (B) 成人は11日目に出現し始める。 バイアルを毎日観察するスケジュールを設定し、好ましくは1日の同じ時間に、慎重にあなたの観察を記録します。 すべての子犬が出現したときにカウントを停止し(空の子犬のケースをカウント)、15日目に実験を停止してハエの次世代を数えるのを避け、もし(黒/乾燥した子犬)場合は死んだ子犬を数えます。 ライフサイクルが長い変異体は、より長い期間を必要とし、経験的に決定する必要があります。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 補足図。これらのファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。   補足資料。これらのファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。