Uso di tessuto congelato nel saggio Cometa per la valutazione del danno del DNA

Il test della cometa è sempre più usato come mezzo per valutare il danno del DNA nelle cellule coltivate e nei tessuti esposti a sostanze chimiche o altri fattori di stress ambientali¹. L’analisi è in grado di rilevare rotture a doppio e singolo filamento del DNA, lesioni alcali-labili e rotture a singolo filamento associate alla riparazione incompleta del DNA. L’International Council for Harmonization of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH) guideline for Pharmaceutical testing raccomanda una rottura del filamento di DNA, come il saggio della cometa come secondo test per integrare il micronucleo eritrocite del roditore per la valutazione della genotossicità in vivo e come test di follow-up per valutare la modalità di azione degli organi nel bersaglio di induzione tumorale². L’Autorità europea per la sicurezza alimentare (EFSA) raccomanda il test della cometa in vivo come test di follow-up adeguato per studiare la pertinenza di un risultato positivo in un test di genotossicità in vitro³. Nel 2014 è stata approvata una linea guida per i test dell’OCSE per il test della cometa sui roditori, aumentando così l’accettabilità del saggio da utilizzare nei test normativi del potenziale genotossico. Il saggio si basa sulla separazione elettroforetica di loop di DNA rilassati e frammenti che migrano dai nucleoidi delle cellule lisci. Fondamentalmente, singole cellule sono incorporate in agarose che è stato stratificato su vetrini al microscopio. I vetrini vengono poi immersi nel buffer di lisi seguita da una soluzione alcalina (pH > 13), che consente al DNA nucleare strettamente arrotolato di rilassarsi e rilassarsi. Le diapositive vengono poi collocate in un campo elettrico, che stimola la migrazione del DNA caricato negativamente verso l’anodo, creando immagini che assomigliano alle comete; la quantità relativa di DNA nella coda della cometa rispetto alla testa della cometa è direttamente proporzionale alla quantità di danno del DNA; Il contenuto di DNA nella coda viene in genere quantificato utilizzando un software di imaging digitale.

Poiché il saggio della cometa rileva il DNA frammentato, la quantificazione accurata del danno del DNA indotto dall’esposizione può essere confusa dalla frammentazione della cromatina associata alla necrosi o all’apoptosi derivante dalla citotossicità o dallo stress indotta dal trattamento. Inoltre, il danno al DNA può verificarsi a causa di tosatura meccanica o elaborazione impropria del campione⁴. L’importanza di mantenere il tessuto raccolto raffreddato prima della preparazione dello scivolo per ridurre al minimo il livello di base del danno al DNA è stata precedentemente dimostrata^5,6. Molti laboratori preparano scivoli di assaggio cometa da tessuti freschi; tuttavia, questo può essere logisticamente impegnativo quando si preparano diapositive da più tipi di tessuto per animale in uno studio con un gran numero di animali. Inoltre, questo presenta un problema quando la preparazione e l’analisi delle diapositive devono avvenire in un laboratorio remoto, che richiede la spedizione di campioni. Ad esempio, il National Toxicology Program degli Stati Uniti include il saggio della cometa come componente del suo programma di test di tossicologia genetica (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) e talvolta incorpora il saggio in studi di tossicità a dose ripetuta di 28 o 90 giorni; ciò richiede la raccolta di tessuti da parte del laboratorio in vita e il trasferimento di campioni in un altro laboratorio per l’analisi. Per raggiungere questo obiettivo, i pezzi di tessuto vengono macinati e/o le cellule epiteliali del tratto gastrointestinale vengono raschiate e le sospensioni cellulari vengono congelate flash e conservate in un congelatore per la successiva spedizione e conservazione da parte del laboratorio ricevente fino all’analisi⁷. Una corretta gestione dei campioni è fondamentale per ottenere dati di alta qualità utilizzando tessuti congelati; tuttavia, la manipolazione riproducibile di campioni di tessuto durante le necropsie eseguite da personale in continua evoluzione è difficile da controllare, soprattutto nei laboratori in vita che non raccolgono regolarmente tessuti per il saggio della cometa. La formazione di aggiornamento del personale necropy o l’uso di un’unità mobile composta da personale di laboratorio esperto per raccogliere campioni di tessuto freschi o congelati è spesso troppo costosa, non fattibile o semplicemente sottovalutata.

Per garantire una migliore generazione coerente di campioni di tessuto di alta qualità per il trasferimento in un sito remoto per l’analisi del test della cometa, è stata esplorata l’utilità di un metodo pubblicato⁶ di conservazione dei tessuti da cubi di tessuto congelati flash. In questo metodo, i cubetti di tessuto congelati vengono caricati in un dispositivo di mintura del tessuto in acciaio inossidabile (Figura 1) che viene collocato in un tubo di microcentrifuga contenente tampone freddo. Il cubo di tessuto viene quindi spinto attraverso una piccola rete di calibro alla fine del dispositivo. Forzando ripetutamente la sospensione del tessuto attraverso il setaccio di maglia in entrambe le direzioni più volte si traduce in una sospensione a cella singola relativamente uniforme. I campioni preparati con questo metodo confrontano favorevolmente la qualità acampioni di tessuto fresco e congelato preparati mediante la macidia. Come ulteriore vantaggio, a differenza dei campioni macinati, i cubi di tessuto possono essere conservati congelati per periodi prolungati di tempo e ancora producono risultati di alta qualità nel saggio della cometa.