Gebruik van bevroren weefsel in de Komeet Assay voor de evaluatie van DNA-schade

De komeettest wordt steeds vaker gebruikt als middel om DNA-schade te evalueren in gekweekte cellen en weefsels die worden blootgesteld aan chemicaliën of andere milieustressoren¹. De test kan detecteren DNA dubbele- en single-streng pauzes, alkali-galiele laesies, en single-streng pauzes geassocieerd met onvolledige DNA-reparatie. De richtsnoer van de Internationale Raad voor harmonisatie van de technische voorschriften voor farmaceutische producten voor menselijk gebruik (ICH) beveelt een DNA-strengbreuk zoals de komeettest aan als een tweede test ter aanvulling van de micronucleustest van knaagdieren voor de beoordeling van in vivo genotoxiciteit en als vervolgtest voor de beoordeling van de werkingswijze in doelorganen van tumorinductie². De Europese Autoriteit voor voedselveiligheid (EFSA) beveelt de in vivo komeettest aan als een geschikte follow-uptest om de relevantie van een positief resultaat in een in vitro genotoxiciteitstest te onderzoeken³. In 2014 werd een OESO-testrichtlijn goedgekeurd voor de test van de knaagdierkomeet, waardoor de aanvaardbaarheid van de test voor gebruik bij het testen van genotoxische stoffen in de regelgeving werd verhoogd. De test is gebaseerd op de elektroforetische scheiding van ontspannen DNA-lussen en fragmenten die migreren uit nucleoids van lysed cellen. Kortom, enkele cellen zijn ingebed in agarose die is gelaagd op microscoop dia’s. Dia’s worden vervolgens ondergedompeld in lysis buffer gevolgd door een alkalische (pH > 13) oplossing, die het mogelijk maakt de strak opgerolde nucleaire DNA te ontspannen en te ontspannen. Dia’s worden dan geplaatst in een elektrisch veld, dat migratie van negatief geladen DNA naar de anode stimuleert, waardoor beelden ontstaan die lijken op kometen; de relatieve hoeveelheid DNA in de komeetstaart in vergelijking met de komeetkop is rechtstreeks evenredig met de hoeveelheid DNA-schade; DNA-inhoud in de staart wordt meestal gekwantificeerd met behulp van digitale imaging software.

Omdat de komeettest gefragmenteerd DNA detecteert, kan nauwkeurige kwantificering van door blootstelling veroorzaakte DNA-schade worden verward met chromatinefragmentatie geassocieerd met necrose of apoptose als gevolg van door de behandeling veroorzaakte cytotoxiciteit of stress. Bovendien kan DNA-schade optreden als gevolg van mechanische afschuiaal of onjuiste monsterverwerking⁴. Het belang van het behoud van geoogst weefsel gekoeld voorafgaand aan dia voorbereiding om de basislijn niveau van DNA-schade te minimaliseren is eerder aangetoond^5,6. Vele laboratoria bereiden komeettestdia’s van vers weefsel; Dit kan echter logistiek uitdagend zijn bij het voorbereiden van dia’s van meerdere weefseltypen per dier in een studie met een groot aantal dieren. Bovendien vormt dit een probleem wanneer diavoorbereiding en -analyse zich in een extern laboratorium moeten voordoen, waardoor de verzending van monsters noodzakelijk is. Bijvoorbeeld, het Amerikaanse National Toxicology Program bevat de komeet test als onderdeel van haar genetische toxicologie testen programma (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) en soms bevat de test in 28 of 90 dagen herhalen dosis toxiciteit studies; dit vereist het verzamelen van weefsel door het in-life laboratorium en de overdracht van monsters naar een ander laboratorium voor analyse. Om dit te bereiken, worden weefselstukken gehakt, en/of epitheelcellen van het maag-darmkanaal worden geschraapt en cellulaire suspensuspensie worden flash bevroren en opgeslagen in een vriezer voor latere verzending en opslag door het ontvangende laboratorium tot analyse⁷. Een goede behandeling van monsters is van cruciaal belang voor het verkrijgen van gegevens van hoge kwaliteit met behulp van bevroren weefsel; echter, reproduceerbare manipulatie van weefselmonsters tijdens necropsies uitgevoerd door steeds veranderende personeel is moeilijk te controleren, vooral bij in-life laboratoria die niet routinematig oogsten weefsels voor de komeet test. Opfristraining van obductiepersoneel of het gebruik van een mobiele eenheid die wordt bemand door ervaren laboratoriumpersoneel om verse of bevroren weefselmonsters te verzamelen, is vaak te duur, niet haalbaar of gewoon ondergewaardeerd.

Om een consistente generatie van hoogwaardige weefselmonsters beter te garanderen voor overdracht naar een afgelegen locatie voor comettestanalyse, werd het nut van een gepubliceerde methode⁶ van weefselbehoud van vlambevroren kubussen van weefsel onderzocht. Bij deze methode worden bevroren blokjes weefsel geladen in een roestvrijstalen weefselverwikringsapparaat (figuur 1) dat in een microcentrifugebuis met koude buffer wordt geplaatst. De kubus van weefsel wordt vervolgens geduwd door een kleine meter gaas aan het einde van het apparaat. Herhaaldelijk dwingen van het weefsel suspensie door de mesh zeef in beide richtingen meerdere malen resulteert in een relatief uniforme eencellige suspensie. Monsters bereid door deze methode gunstig in kwaliteit vergeleken met zowel verse als bevroren weefsel monsters bereid door hakken. Als bijkomend voordeel, in tegenstelling tot gehakte monsters, kunnen weefselkubussen gedurende langere tijd bevroren worden opgeslagen en nog steeds resultaten van hoge kwaliteit opleveren in de komeettest.