Verwendung von gefrorenem Gewebe im Kometentest zur Bewertung von DNA-Schäden

Der Kometentest wird zunehmend als Mittel zur Bewertung von DNA-Schäden in kultivierten Zellen und Geweben verwendet, die Chemikalien oder anderen Umweltstressoren ausgesetzt sind¹. Der Test kann DNA-Doppel- und Einstrangbrüche, alkali-labile Läsionen und einsträngige Brüche im Zusammenhang mit unvollständiger DNA-Reparatur erkennen. Der International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH) empfiehlt einen DNA-Strangbruchtest wie den Kometentest als zweiten Test zur Ergänzung des Nagetier-Erythrozyten-Mikrokern-Assays zur Beurteilung der In-vivo-Genotoxizität und als Folgetest zur Beurteilung der Wirkungsweise in Zielorganen der Tumorinduktion². Die Europäische Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA) empfiehlt den In-vivo-Kometentest als geeigneten Folgetest zur Untersuchung der Relevanz eines positiven Ergebnisses in einem In-vitro-Genotoxizitätstest³. Im Jahr 2014 wurde eine OECD-Testrichtlinie für den Nagetierkometentest genehmigt, wodurch die Akzeptanz des Assays für die Anwendung bei regulatorischen Tests des genotoxischen Potenzials erhöht wurde. Der Test basiert auf der elektrophoretischen Trennung von entspannten DNA-Schleifen und Fragmenten, die aus Nukleoiden von lysierten Zellen wandern. Grundsätzlich sind einzelne Zellen in Agarose eingebettet, die auf Mikroskopschlitten geschichtet wurde. Die Dias werden dann in den Lysepuffer eingetaucht, gefolgt von einer alkalischen (pH > 13) Lösung, die es der fest gewickelten Kern-DNA ermöglicht, sich zu entspannen und zu entspannen. Dias werden dann in ein elektrisches Feld gelegt, das die Migration negativ geladener DNA zur Anode stimuliert und Bilder erzeugt, die Kometen ähneln; die relative MENGE der DNA im Kometenschweif im Vergleich zum Kometenkopf ist direkt proportional zur Menge der DNA-Schäden; DER DNA-Gehalt im Schwanz wird in der Regel mit hilfe digitaler Bildgebungssoftware quantifiziert.

Da der Kometentest fragmentierte DNA erkennt, kann eine genaue Quantifizierung von expositionsinduzierten DNA-Schäden durch Chromatinfragmentierung im Zusammenhang mit Nekrose oder Apoptose infolge behandlungsinduzierter Zytotoxizität oder Stress verwirrt werden. Darüber hinaus kann eine DNA-Schädigung durch mechanisches Scheren oder unsachgemäße Probenbearbeitung auftreten⁴. Die Bedeutung der Aufrechterhaltung des vor der Folienvorbereitung gekühlten Erntegewebes zur Minimierung des Ausgangsniveaus der DNA-Schäden wurde bereits^5,6gezeigt. Viele Laboratorien bereiten Kometenasssay-Dias aus frischem Gewebe vor; Dies kann jedoch logistisch eine Herausforderung darstellen, wenn diaginen von mehreren Gewebetypen pro Tier in einer Studie mit einer großen Anzahl von Tieren vorbereitet werden. Darüber hinaus stellt dies ein Problem dar, wenn die Vorbereitung und Analyse von Dias in einem entfernten Labor erfolgen soll, was den Versand von Proben erforderlich macht. Zum Beispiel umfasst das U.S. National Toxicology Program den Kometentest als Bestandteil seines genetischen toxikologischen Testprogramms (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) und nimmt den Assay manchmal in 28 oder 90-Tage-Studien zur Toxizität bei wiederholter Totdosis auf; dies erfordert die Entnahme von Gewebe durch das Labor im Leben und die Übertragung von Proben in ein anderes Labor zur Analyse. Um dies zu erreichen, werden Gewebeteile gehackt und/oder Epithelzellen des Magen-Darm-Traktes abgekratzt und Zellsuspensionen werden eingefroren und in einem Gefrierschrank für die nachfolgende Verbringung und Lagerung durch das empfangende Labor bis zur Analyse⁷gelagert. Die ordnungsgemäße Handhabung von Proben ist entscheidend für die Beschaffung hochwertiger Daten mit gefrorenem Gewebe; Reproduzierbare Manipulation von Gewebeproben während Nekropsien, die von ständig wechselndem Personal durchgeführt werden, ist jedoch schwer zu kontrollieren, insbesondere in Labors, die nicht routinemäßig Gewebe für den Kometentest ernten. Die Auffrischung des Nekropsiepersonals oder die Nutzung einer mobilen Einheit, die von erfahrenem Laborpersonal besetzt ist, um frische oder gefrorene Gewebeproben zu sammeln, ist oft zu kostspielig, nicht durchführbar oder einfach unterbewertet.

Um eine konsistente Generierung hochwertiger Gewebeproben für die Übertragung an einen entfernten Ort für kometenassatoume Analysen zu gewährleisten, wurde der Nutzen einer veröffentlichten Methode⁶ der Gewebekonservierung aus eingefrorenen Flash-Gewebewürfeln untersucht. Bei dieser Methode werden gefrorene Gewebewürfel in eine Gewebeminkvorrichtung aus Edelstahl(Abbildung 1) geladen, die in ein Mikrozentrifugenrohr mit Kaltpuffer gelegt wird. Der Gewebewürfel wird dann durch ein kleines Messnetz am Ende des Geräts geschoben. Das wiederholte Zwingen der Gewebesuspension durch das Netzsieb in beide Richtungen führt zu einer relativ gleichmäßigen einzelzelligen Suspension. Proben, die mit dieser Methode hergestellt wurden, verglichen in der Qualität sowohl mit frischen als auch gefrorenen Gewebeproben, die durch Hacken hergestellt wurden. Als zusätzlichen Vorteil, im Gegensatz zu Hackfleischproben, Gewebewürfel können gefroren für längere Zeit gelagert werden und dennoch qualitativ hochwertige Ergebnisse in der Kometen-Assay liefern.