استخدام الأنسجة المجمدة في فحص المذنب لتقييم تلف الحمض النووي
Summary
يصف هذا البروتوكول العديد من الإجراءات لإعداد عينات الأنسجة المجمدة عالية الجودة في وقت التشريح لاستخدامها في فحص المذنب لتقييم تلف الحمض النووي: 1) الأنسجة المفرومة، 2) الخلايا الظهارية الكشط من الجهاز الهضمي، و 3) الأنسجة المكعبة عينات، مما يتطلب التجانس باستخدام جهاز تصغير الأنسجة.
Abstract
يكتسب فحص المذنب شعبية كوسيلة لتقييم تلف الحمض النووي في الخلايا والأنسجة المستزرعة ، خاصة بعد التعرض للمواد الكيميائية أو الضغوطات البيئية الأخرى. وقد كان الدافع وراء استخدام فحص المذنبفي الاختبارات التنظيمية لإمكانات السمية الجينية في القوارض هو اعتماد مبدأ توجيهي لاختبار منظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي في عام 2014. عادة ما يتم إعداد شرائح فحص المذنب من الأنسجة الطازجة في وقت النُقال. ومع ذلك ، يمكن تجميد عينات الأنسجة تجنب التحديات اللوجستية المرتبطة بالتحضير المتزامن للشرائح من أعضاء متعددة لكل الحيوان ومن العديد من الحيوانات في كل دراسة. كما يتيح التجميد عينات الشحن من مرفق التعرض إلى مختبر مختلف للتحليل، ويسهل تخزين الأنسجة المجمدة تأجيل اتخاذ قرار بتوليد بيانات تلف الحمض النووي لجهاز معين. إن فحص المذنب القلوي مفيد للكشف عن الحمض النووي المرتبط بالتعرض، فواصل مزدوجة وأحادية، وآفات قلوية-لابيلي، وفواصل حبلا مرتبطة بإصلاح الختان غير الكامل للحمض النووي. ومع ذلك ، يمكن أن ينتج تلف الحمض النووي أيضًا عن القص الميكانيكي أو إجراءات معالجة العينات غير السليمة ، مما يربك نتائج الفحص. وقد يكون من الصعب التحكم في إمكانية استنساخ عينات الأنسجة أثناء النُقات ومعالجتها بسبب تقلب موظفي المختبرات ذوي المستويات المختلفة من الخبرة في حصاد الأنسجة الخاصة بإمكانية فحص المذنب. وتعزيز الاتساق من خلال التدريب على تجديد المعلومات أو نشر وحدات متنقلة مزودة بموظفين من ذوي الخبرة في المختبرات أمر مكلف وقد لا يكون ممكنا دائما. لتحسين توليد متسقة من عينات ذات جودة عالية لتحليل المقنب، تم تقييم طريقة لتجانس مكعبات فلاش المجمدة من الأنسجة باستخدام جهاز mincing الأنسجة مخصصة. عينات أعدت لفحص المذنب من قبل هذه الطريقة مقارنة بشكل إيجابي في الجودة لعينات الأنسجة الطازجة والمجمدة التي أعدتها mincing أثناء النُقات. وعلاوة على ذلك، تم قياس انخفاض الضرر الحمض النووي الأساسي في الخلايا من مكعبات المجمدة من الأنسجة بعد التخزين لفترات طويلة.
Introduction
يستخدم فحص المذنب بشكل متزايد كوسيلة لتقييم تلف الحمض النووي في الخلايا المستزرعة والأنسجة المعرضة للمواد الكيميائية أو الضغوطات البيئية الأخرى1. يمكن للفحص الكشف عن فواصل الحمض النووي المزدوج وأحادية، والآفات القلوية والآفية، وفواصل حبلا واحدة المرتبطة بإصلاح الحمض النووي غير مكتملة. يوصي المجلس الدولي لتنسيق المتطلبات التقنية للمستحضرات الصيدلانية للاستخدام البشري (ICH) بالمبادئ التوجيهية للاختبار الصيدلاني بفاصل خيط الحمض النووي مثل فحص المذنب كاختبار ثان ٍ لتكملة قياس النواة المجهرية لمادة الكريات والقوارض لتقييم السمية الجينية للقدرة العضوية العضوية العضوية الحمراء وكاختبار متابعة لتقييم طريقة العمل في الأعضاء المستهدفة لتحريض الورم2. توصي الهيئة الأوروبية لسلامة الأغذية (EFSA) بالفحص في حالة التسمم على المذنب كاختبار متابعة مناسب للتحقيق في مدى أهمية النتيجة الإيجابية في اختبار السمية الجينية في المختبر3. وفي عام 2014، تمت الموافقة على مبدأ توجيهي لاختبار منظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي فيما يتعلق بفحص المذنبات القوارض، مما زاد من مقبولية القول لاستخدامه في الاختبارات التنظيمية لإمكانات السمية الجينية. ويستند هذا الفحص على الفصل الكهربائي من حلقات الحمض النووي استرخاء والشظايا التي تهاجر من الخلايا المنتحلة. في الأساس ، يتم تضمين الخلايا المفردة في agarose التي تم طبقات على شرائح المجهر. ثم يتم غمر الشرائح في المخزن المؤقت حل السليس تليها القلوية (درجة الحموضة > 13) الحل، والذي يسمح للحمض النووي ملفوف بإحكام للاسترخاء والاسترخاء. ثم توضع الشرائح في حقل كهربائي، مما يحفز هجرة الحمض النووي المشحون سلبا نحو الأنود، مما يخلق صورا تشبه المذنبات؛ المقدار النسبي للحمض النووي في ذيل المذنب مقارنة مع رأس المذنب يتناسب بشكل مباشر مع كمية تلف الحمض النووي؛ عادة ما يتم قياس محتوى الحمض النووي في الذيل باستخدام برامج التصوير الرقمي.
نظرًا لأن مقاز المذنب يكشف الحمض النووي المجزأ ، فإن التحديد الكمي الدقيق لتلف الحمض النووي الناجم عن التعرض يمكن أن يُمكن أن يُربك بسبب تجزؤ الكروماتين المرتبط بالنخر أو الخلايا المبرمجة الناتجة عن السمية أو الإجهاد الناجم عن العلاج. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يحدث تلف الحمض النووي نتيجة للقص الميكانيكي أو معالجة العينة غير السليمة4. وقد أظهرت أهمية الحفاظ على الأنسجة المحصودة المبردة قبل إعداد الشريحة لتقليل مستوى خط الأساس لتلف الحمض النووي في السابق5,6. العديد من المختبرات إعداد الشرائح فحص المذنب من الأنسجة الطازجة; ومع ذلك ، يمكن أن يكون هذا تحديًا لوجستيًا عند إعداد الشرائح من أنواع الأنسجة المتعددة لكل الحيوان في دراسة مع عدد كبير من الحيوانات. وعلاوة على ذلك، فإن هذا يمثل مشكلة عندما يتم إعداد وتحليل الشرائح في مختبر بعيد، مما يستلزم شحن العينات. على سبيل المثال، يتضمن البرنامج الوطني الأمريكي لعلم السموم فحص المذنب كعنصر في برنامج اختبار السموم الوراثية (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) ويدمج في بعض الأحيان الفحص في دراسات سمية الجرعة المتكررة لمدة 28 أو 90 يومًا؛ وهذا يتطلب جمع الأنسجة من قبل المختبر في الحياة ونقل العينات إلى مختبر آخر للتحليل. لتحقيق ذلك ، يتم مفروم قطع الأنسجة ، ويتم كشط / أو الخلايا الظهارية في الجهاز الهضمي ويتم تجميد التعليق الخلوي وتخزينها في ثلاجة للشحن والتخزين اللاحق من قبل المختبر المتلقي حتى التحليل7. التعامل السليم مع العينات أمر بالغ الأهمية للحصول على بيانات عالية الجودة باستخدام الأنسجة المجمدة. ومع ذلك ، فإن التلاعب القابل للتكرار لعينات الأنسجة أثناء النُسج الذي يقوم به أفراد دائمي التغير يصعب السيطرة عليه ، خاصة في المختبرات في الحياة التي لا تحصد الأنسجة بشكل روتيني لفحص المذنب. وغالبا ً ما يكون التدريب المنعش لموظفي التشريح أو استخدام وحدة متنقلة يعمل بها موظفون مختبرون متمرسون لجمع عينات من الأنسجة الطازجة أو المجمدة مكلفاً للغاية، أو غير ممكن، أو مجرد التقليل من قيمته.
لضمان توليد متسقة على نحو أفضل من عينات الأنسجة عالية الجودة لنقلها إلى موقع بعيد لتحليل فحص المذنب ، تم استكشاف فائدة الطريقة المنشورة6 لحفظ الأنسجة من مكعبات الأنسجة المجمدة الفلاشية. في هذه الطريقة، يتم تحميل مكعبات المجمدة من الأنسجة في جهاز mincing الأنسجة الفولاذ المقاوم للصدأ(الشكل 1)التي يتم وضعها في أنبوب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على عازلة الباردة. ثم يتم دفع مكعب الأنسجة من خلال شبكة قياس صغيرة في نهاية الجهاز. إجبار تعليق الأنسجة مرارا وتكرارا من خلال منخل شبكة في كلا الاتجاهين عدة مرات يؤدي إلى تعليق خلية واحدة موحدة نسبيا. عينات أعدت من قبل هذه الطريقة مقارنة إيجابية في الجودة لكل من عينات الأنسجة الطازجة والمجمدة التي أعدتها mincing. كفائدة إضافية ، على عكس العينات المفرومة ، يمكن تخزين مكعبات الأنسجة المجمدة لفترات طويلة من الزمن ولا تزال تحقق نتائج عالية الجودة في فحص المذنب.
Protocol
Representative Results
Discussion
كما ثبت سابقا7،12،13، التعامل بشكل صحيح فلاش الأنسجة المفرومة المجمدة يوفر نتائج جيدة في فحص المذنب. في الواقع، خط الأساس % قيم الحمض النووي الذيل للفئران المفروم المجمدة والكبد الماوس أعدت في مختبرنا عادة ≤ 6٪، كما أوصى به المبدأ التوجيهي …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفون مدينون لينكولن مارتن وكيلي أوينز للمساعدة التقنية الخبراء إعداد وتسجيل الشرائح المذنب والدكتور كارول شوارتز لإجراء التحليلات الإحصائية. كما يعترف المؤلفون بالمساهمات الداعمة لأعضاء برامج علم السموم الوراثية، وعلم السموم الاستقصائي، والنُسب في ILS.
Materials
| Cryovials | Corning Costar | 430488 | |
| Dental Wax Sheets | Electron Microscopy Sciences | 72670 | |
| Dissecting (Mincing) Micro Scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Low Melting Point Agarose | Lonza | 50081 | |
| Microfuge Tubes (1.7 mL ) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Neutral Buffered Formalin | Leica | 600 | |
| Scalpel Blades | Miltex | 4-110 | |
| Syringe Plunger (1 mL ) | Fisher Scientific or Vitality Medical | 14-826-88; 8881901014 | Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe |
| Tissue Mincing Device | NorGenoTech (Oslo, Norway) | None | Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger. |
| Tweezers, plastic | Trade Winds Direct | DF8088N | Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com |
| Weigh Boats | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
References
- van der Leede, B. J., et al. Performance and data interpretation of the in vivo comet assay in pharmaceutical industry: EFPIA survey results. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 775-776, 81-88 (2014).
- ICH. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) S2(R1): Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. ICH. , (2012).
- EFSA. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
- Lorenzo, Y., Costa, S., Collins, A. R., Azqueta, A. The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead. Mutagenesis. 28 (4), 427-432 (2013).
- Guerard, M., Marchand, C., Plappert-Helbig, U. Influence of experimental conditions on data variability in the liver comet assay. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (2), 114-121 (2014).
- Jackson, P., et al. Validation of freezing tissues and cells for analysis of DNA strand break levels by comet assay. Mutagenesis. 28 (6), 699-707 (2013).
- Recio, L., Kissling, G. E., Hobbs, C. A., Witt, K. L. Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (2), 101-113 (2012).
- Uno, Y., et al. JaCVAM-organized international validation study of the in vivo rodent alkaline comet assay for detection of genotoxic carcinogens: II. Summary of definitive validation study results. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 45-76 (2015).
- OECD. OECD Guideline for the Testing of Chemicals: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. 489, (2016).
- Hobbs, C. A., et al. Comet assay evaluation of six chemicals of known genotoxic potential in rats. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 172-181 (2015).
- Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver. Journal of Visualized Experiments. (111), 53833 (2016).
- Hobbs, C. A., Chhabra, R. S., Recio, L., Streicker, M., Witt, K. L. Genotoxicity of styrene-acrylonitrile trimer in brain, liver, and blood cells of weanling F344 rats. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (3), 227-238 (2012).
- Hobbs, C. A., et al. Comprehensive evaluation of the flavonol anti-oxidants, alpha-glycosyl isoquercitrin and isoquercitrin, for genotoxic potential. Food and Chemical Toxicology. 113, 218-227 (2018).
- Pant, K., et al. Vehicle and positive control values from the in vivo rodent comet assay and biomonitoring studies using human lymphocytes: historical database and influence of technical aspects. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 633-642 (2014).
