Monster voorbereiding voor Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Massaspectrometrie (MS) is een technologische realisatie van reductionisme; het reduceert het analyseobject tot een eenheid die kan worden geïnterpreteerd op basis van moleculaire soorten of cascades. Daarom is het een representatieve methode van analytische chemie. Het bestaat uit vier processen: ionisatie, analyse, detectie en spectrale acquisitie. Omdat ionisatie van het molecuul het eerste proces in massaspectrometrie is, beperkt het over het algemeen de vorm van de te verwerken analyten. De meeste ionisatieprocedures vereisen de vernietiging van de structuur, morfologie en real-time biologische processen van organische monsters. Bijvoorbeeld, elektrospray ionisatie (ESI) MS vereist dat de monsters in een vloeibare toestand voor efficiënte ionisatie¹. Monsters moeten daarom door een complex biochemisch preparaat gaan, dat de samenstelling van moleculen verandert. Als alternatief, terwijl matrix-assisted laser desorptie ionisatie (MALDI) MS moleculaire kaarten van dun gesectioneerd weefsel^2,3kan reconstrueren, is de ionisatie-efficiëntie te laag om alle moleculen in de monsters te detecteren, en het is bijzonder slecht in het analyseren van vetzuren. Gezien deze beperkingen kan sondeelektrosprayionisatie (PESI)⁴ worden gebruikt om de real-time veranderingen in biologische systemen in situ waar te nemen zonder de structurele integriteit te vernietigen⁵, terwijl het biologische organisme dat wordt waargenomen technisch in levende staat is. Een zeer fijne naald wordt gebruikt in dit geval die gelijktijdig dient als een monster picker en een ionenzender. Dit betekent dat de complexe monstervoorbehandelingssequenties kunnen worden omzeild om massaspectra te verkrijgen die de moleculaire componenten van het levende systeem in situ weerspiegelen.

Er zijn verschillende andere ionisatiemethoden die wedijveren met PESI-MS. Een daarvan is snelle verdampingsionisatie massaspectrometrie (REIMS)⁶. Deze techniek werkt goed tijdens de operatie, omdat het is gemonteerd met een elektrisch mes en verzamelt de ionenpluim gegenereerd tijdens incisie. Terwijl REIMS is zeer nuttig voor de operatie, het is in wezen een destructieve methode die de elektrische ablatie van het weefsel vereist. Daarom is het niet nuttig voor de gedetailleerde analyse van cellen en weefsels in een preparatief monster of in laboratoriumanalyses. Bovendien, omdat het verzamelt een grote hoeveelheid pluim met weefselpuin, het vereist langdurig onderhoud van de apparaten na elk gebruik, waardoor het gebruik van deze machine te beperken tot speciale chirurgische ingrepen. Een soortgelijke methode, genaamd laser desorptie ionisatie massaspectrometrie (LDI-MS)⁷, is een andere techniek die niet-invasief en nuttig voor het oppervlak analyse. Omdat deze techniek goed is in het scannen van het oppervlak van een monster, bereikt het uitgebreide tweedimensionale analyse zoals MALDI imaging massaspectrometrie^8,9. Omdat LDI-MS echter alleen van toepassing is op de oppervlakteanalyse, is PESI-MS voordelig voor het analyseren van de monsters, bijvoorbeeld binnen het weefsel. Een andere techniek, de MasSpec Pen¹⁰, werd gemeld om een hoge specificiteit en gevoeligheid te bereiken bij de diagnose van schildklierkanker, maar de diameter van de sonde is in de orde van mm en het is specifiek voor de oppervlakte-analyse, wat betekent dat het niet kan detecteren kleine knobbeltjes van kanker of diep gelokaliseerde laesies. Aangezien deze methode gebruik maakt van een microcapillary flow canal ingebed in de sondepen, moet bovendien rekening worden gehouden met kruisbesmetting, vergelijkbaar met LDI-MS. Andere technieken bestaan die zijn toegepast op klinische instellingen, zoals de stroom sonde en ionisatie vorm swab¹¹, maar ze zijn niet wijdverbreid.

PESI is extreme miniaturisatie van ESI, waarin de capillaire van de nano-elektrospray convergeert op een vaste naald met een tip kromming straal van enkele honderden nm. Ionisatie vindt plaats in het uiterst beperkte gebied van de naaldtip door een Taylor-kegel te vormen, waarop monsters blijven totdat de ionisatie van alle vloeistof op de punt is voltooid¹². Als de analyt op de punt van de metalen naald blijft, wordt de overbelasting continu gegenereerd op de interface tussen de metalen naald en de analyten. Daarom vindt sequentiële ionisatie van moleculen plaats, afhankelijk van hun oppervlakteactiviteit. Deze eigenschap maakt de naald tip een soort chromatogram, het scheiden van de analyten, afhankelijk van hun oppervlakteactiviteit. Meer technisch, moleculen met de sterkere oppervlakteactiviteit komen aan het oppervlak van de Taylor kegel en worden geïoniseerd eerder dan die met een zwakkere oppervlakteactiviteit, die zich hechten aan het oppervlak van de naald tot het einde van het ionisatieproces. Zo wordt volledige ionisatie van alle moleculen die door de naald worden opgepikt bereikt¹³. Bovendien, omdat deze techniek niet de toevoeging van overbodig oplosmiddel aan het monster impliceert, volstaan enkele honderden femtoliters om massaspectra sterk genoeg te krijgen voor verdere analyse¹⁴. Deze eigenschappen zijn gunstig voor de analyse van intacte biologische monsters. Een groot nadeel van PESI-MS ligt echter in de discontinuïteit in ionisatie vanwege de wederkerige beweging van de naald langs de verticale as, vergelijkbaar met een zaagmachine. Ionisatie vindt alleen plaats wanneer de punt van de sonde het hoogste punt bereikt wanneer de hoogte van de ionenopening op de horizontale as is uitgelijnd. Ionisatie stopt terwijl de naald monsters oppikt, en dus is de stabiliteit van ionisatie niet gelijk aan die in conventionele ESI. Daarom is PESI-MS geen ideale methode voor proteomics.

Tot op heden is PESI-MS voornamelijk toegepast op de analyse van biologische systemen, die een breed scala aan gebieden bestrijken, van fundamenteel onderzoek tot klinische instellingen. Bijvoorbeeld, de directe analyse van menselijk weefsel voorbereid tijdens de operatie was in staat om de accumulatie van triacylglycerol onthullen in zowel niercel carcinoom¹⁵ en faryngeal plaveiselcarcinoom¹⁶. Deze methode kan ook vloeibare monsters, zoals bloed, meten om zich te concentreren op het lipideprofiel. Sommige moleculen zijn bijvoorbeeld afgebakend tijdens veranderingen in het dieet bij konijnen; er werd gemeld dat sommige van deze moleculen in zeer vroeg stadium van de experimenten afdaalden, wat wijst op de hoge gevoeligheid en het nut van dit systeem voor klinische diagnose¹⁷. Bovendien, directe toepassing op een levend dier toegestaan de detectie van biochemische veranderingen van de lever na slechts een nacht van vasten⁵. Zaitsu et al.¹⁸ revisited dit experiment⁵ en analyseerde de metabole profielen van de lever op bijna dezelfde manier, met resultaten die de stabiliteit en reproduceerbaarheid van onze oorspronkelijke methode versterkt. Bovendien waren we in staat om het kankerweefsel te discrimineren van omliggende niet-kankerlever bij muizen met behulp van deze techniek¹⁹. Daarom is dit een veelzijdige massaspectrometrietechniek die nuttig is in verschillende omgevingen, zowel in vivo als in vitro. Vanuit een ander oogpunt kan de PESI-module worden gemaakt om verschillende massaspectrometers te passen door de montagebevestiging aan te passen. In dit korte artikel introduceren we de basisprincipes en voorbeelden van toepassingen (figuur 1),inclusief toepassingen met levende dieren⁵.

Volgens de verordeningen en wetten in elk land moeten delen van dit protocol worden herzien om aan de criteria van elke instelling te voldoen. Toepassing op het levende organisme is de meest interessante en uitdagende omdat het biochemische of metabole veranderingen in weefsels of organen in levende dieren in situ kan bieden. Hoewel deze aanvraag werd goedgekeurd door het institutioneel comité voor dierverzorging aan de Universiteit van Yamanashi, zal in 2013^5,een nieuwe goedkeuringsronde nodig zijn vanwege recente wijzigingen in de regelgeving voor de dierproeven. Verschillende wijzigingen in de experimentele regeling zijn daarom aan te raden. Met betrekking tot de massaspectra verkregen in experimenten, rekening houdend met de schommelingen van massaspectra tussen elke meting, is er geen spectrale informatie-uitwisseling systeem dat gemeenschappelijk is voor de nucleotide sequencing gemeenschap. Er moet voor worden gezorgd wanneer de bediener de naald hanteert om ongevallen met de naaldprik te voorkomen, vooral bij het verwijderen van de naaldhouder. Een speciaal apparaat voor het losmaken van de naald is hiervoor zeer nuttig. Aangezien het compartiment van de PESI-module een luchtdichte, gesloten kamer is, treedt lekkage van de ionenpluim niet op als de massaspectrometer volgens de instructies wordt bediend.