Preparação de amostras para espectrometria de ionização de eletrospray de sonda

Espectrometria de massa (MS) é uma realização tecnológica do reducionismo; reduz o objeto de análise a uma unidade que pode ser interpretada com base em espécies moleculares ou cascatas. Portanto, é um método representativo de química analítica. É composto por quatro processos: ionização, análise, detecção e aquisição espectral. Como a ionização da molécula é o primeiro processo de espectrometria em massa, ela geralmente restringe a forma dos analytes a serem processados. A maioria dos procedimentos de ionização requerem a destruição da estrutura, morfologia e processos biológicos em tempo real de amostras orgânicas. Por exemplo, a ionização de eletrospray (ESI) exige que as amostras estejam em estado líquido para ionização eficiente¹. As amostras, portanto, devem passar por uma complexa preparação bioquímica, que altera a composição das moléculas. Alternativamente, enquanto a desorização do laser auxiliado por matriz (MALDI) pode reconstruir mapas moleculares de tecido seccionado fino^2,3, sua eficiência de ionização é muito baixa para detectar todas as moléculas nas amostras, e é particularmente ruim em analisar ácidos graxos. Considerando essas limitações, a ionização de eletrospray de sonda (PESI)⁴ pode ser usada para observar as mudanças em tempo real nos sistemas biológicos in situ sem destruir a integridade estrutural⁵, enquanto o organismo biológico observado está tecnicamente em um estado vivo. Uma agulha muito fina é usada neste caso que serve simultaneamente como um catador de amostras e um emissor de íons. Isso significa que as complexas sequências de pré-tratamento amostral podem ser contornadas para obter espectros de massa que refletem os componentes moleculares do sistema vivo in situ.

Existem vários outros métodos de ionização que rivalizam com pesi-ms. Um deles é a espectrometria rápida de ionização evaporativa (REIMS)⁶. Essa técnica funciona bem durante a cirurgia porque é montada com uma faca elétrica e recolhe a pluma de íon gerada durante a incisão. Embora o REIMS seja muito útil para a cirurgia, é essencialmente um método destrutivo que requer a ablação elétrica do tecido. Portanto, não é útil para a análise detalhada de células e tecidos em uma amostra preparatória ou em análises laboratoriais. Além disso, por coletar uma grande quantidade de pluma contendo detritos teciduais, requer uma manutenção longa dos dispositivos após cada uso, limitando assim o uso desta máquina a procedimentos cirúrgicos especiais. Um método semelhante, chamado espectrometria de ionrômetro de ionrização de desorização a laser (LDI-MS)⁷, é outra técnica que não é invasiva e útil para a análise da superfície. Como essa técnica é boa em escanear a superfície de um espécime, ela alcança uma análise bidimensional abrangente como a espectrometria de massa de imagem MALDI^8,9. No entanto, como o LDI-MS só é aplicável à análise da superfície, pesi-MS é vantajoso para analisar as amostras, por exemplo, dentro do tecido. Outra técnica, a MasSpec Pen^10,foi relatada para atingir alta especificidade e sensibilidade no diagnóstico de câncer de tireoide, mas o diâmetro da sonda está na ordem do mm e é específico para a análise da superfície, o que significa que não pode detectar pequenos nódulos de câncer ou lesões profundamente localizadas. Além disso, como este método usa um canal de fluxo microcapilar embutido na caneta da sonda, a contaminação cruzada deve ser levada em consideração, semelhante ao LDI-MS. Existem outras técnicas que foram aplicadas a configurações clínicas, como a sonda de fluxo e o cotonete^11,mas não são generalizados.

PESI é uma miniaturização extrema do ESI, onde o capilar do nano-eletrospray converge em uma agulha sólida com um raio de curvatura de ponta de várias centenas de nm. A ionização ocorre na área extremamente restrita da ponta da agulha, formando um cone Taylor, no qual as amostras permanecem até que a ionização de todo o fluido na ponta seja concluída¹². Se o analyte ficar na ponta da agulha metálica, o excesso de carga é continuamente gerado na interface entre a agulha metálica e os analytes. Portanto, a ionização sequencial de moléculas ocorre dependendo de sua atividade superficial. Esta propriedade faz da ponta da agulha uma espécie de cromatograma, separando os análites dependendo de sua atividade superficial. Mais tecnicamente, moléculas com a atividade superficial mais forte chegam à superfície do cone Taylor e são ionizadas mais cedo do que aquelas com atividade superficial mais fraca, que aderem à superfície da agulha até o final do processo de ionização. Assim, a ionização completa de todas as moléculas captadas pela agulha é alcançada¹³. Além disso, como essa técnica não envolve a adição de solvente supérfluo à amostra, várias centenas de femtolitros são suficientes para obter espectros de massa fortes o suficiente para análise suplementar¹⁴. Essas propriedades são vantajosas para a análise de amostras biológicas intactas. No entanto, uma grande desvantagem do PESI-MS reside na descontinuidade na ionização devido ao movimento recíproco da agulha ao longo do eixo vertical, semelhante a uma máquina de serrar. A ionização só ocorre quando a ponta da sonda atinge o ponto mais alto quando a altura do orifício do íon está alinhada no eixo horizontal. A ionização cessa enquanto a agulha capta amostras, e assim a estabilidade da ionização não é igual à do ESI convencional. Portanto, pesi-ms não é um método ideal para a proteômica.

Até o momento, o PESI-MS tem sido aplicado principalmente à análise de sistemas biológicos, abrangendo uma ampla gama de campos, desde pesquisas básicas até ambientes clínicos. Por exemplo, a análise direta do tecido humano preparado durante a cirurgia foi capaz de revelar o acúmulo de triacylglicerol tanto no carcinoma celular renal¹⁵ quanto na carcinoma faringeal¹⁶. Este método também pode medir amostras líquidas, como sangue, para se concentrar no perfil lipídico. Por exemplo, algumas moléculas foram delineadas durante mudanças alimentares em coelhos; foi relatado que algumas dessas moléculas diminuíram em estágios muito iniciais dos experimentos, indicando a alta sensibilidade e utilidade deste sistema para diagnóstico clínico¹⁷. Além disso, a aplicação direta a um animal vivo permitiu a detecção de alterações bioquímicas do fígado após apenas uma noite de^{jejum 5}. Zaitsu et al.¹⁸ revisitaram este experimento⁵ e analisaram os perfis metabólicos do fígado quase da mesma forma, com resultados que reforçaram a estabilidade e a reprodutibilidade do nosso método original. Além disso, conseguimos discriminar o tecido cancerígeno do fígado não cancerígeno circundante em camundongos usando esta técnica¹⁹. Portanto, trata-se de uma técnica versátil de espectrometria de massa que é útil em várias configurações, tanto in vivo quanto in vitro. Do outro ponto de vista, o módulo PESI pode ser feito para caber vários espectrômetros de massa, ajustando o acessório de montagem. Neste pequeno artigo, introduzimos o básico e exemplos de aplicações (Figura 1),incluindo aplicações com animais vivos⁵.

De acordo com as normas e leis de cada país, partes desse protocolo precisarão ser revistas para atender aos critérios de cada instituição. A aplicação ao organismo vivo é a mais interessante e desafiadora porque pode fornecer alterações bioquímicas ou metabólicas em tecidos ou órgãos em animais vivos in situ. Embora este pedido tenha sido aprovado pelo comitê institucional de cuidados com animais da Universidade de Yamanashi, em 2013⁵, outra rodada de aprovação agora será necessária devido às recentes mudanças nas regulamentações para os experimentos com animais. Várias modificações no esquema experimental são, portanto, aconselháveis. Em relação ao espectro de massa obtido em experimentos, levando em conta as flutuações de espectros de massa entre cada medida, não há um sistema espectral de compartilhamento de informações que seja comum com a comunidade de sequenciamento de nucleotídeos. Deve-se tomar cuidado quando o operador manuseia a agulha para evitar acidentes com agulhas, especialmente quando a retirada da agulha do suporte da agulha. Um dispositivo especial para desprender a agulha é muito útil para este fim. Como o compartimento do módulo PESI é uma câmara hermética e fechada, o vazamento da pluma de íon não ocorre se o espectrômetro de massa for operado de acordo com as instruções.