Summary

単一ヌクレオチド分解能を持つリボソーム転移のメカニズムを研究するデュアルDNA定規

Published: July 08, 2019
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Summary

デュアルDNA定規アッセイは、形成されたDNA-mRNA二重鎖の解離力に依存するリボソーム転位時のmRNA位置を決定するために開発される。単一ヌクレオチド分解能とmRNAの両端に到達する能力を備え、リボソーム転位およびプローブ他の核酸変位に関する機械的洞察を提供できる。

Abstract

リボソーム転位とは、タンパク質合成の中心的なステップである正確に3つのヌクレオチド(nt)によるmRNA上のリボソーム運動を指す。そのメカニズムを調査するには、2 つの重要な技術的要件があります。1つ目は、フレームシフトからの通常の転位を解決できるシングルnt解像度で、その間にリボソームが3nt以外で移動します。2つ目は、mRNAの入口側と出口側の両方を調べ、転移の全体像を解明する能力です。我々は、強制誘発残留磁化分光法(FIRMS)によって得られたDNA-mRNA二重鎖の臨界解離力に基づく二重DNA定規アッセイを報告する。 2-4 pN力分解能を使用すると、デュアルルーラーアッセイは異なる転位ステップを区別するのに十分です。プローブDNに長いリンカーを実装することにより、リボソームの反対側のmRNAに到達できるため、mRNAの位置を両側で決定することができます。したがって、デュアル定規アッセイは、リボソーム転位、および核酸運動全般を調べるのに一意に適している。ループmRNAの立体構造を示し、フレームシフトからの正常な転位を解消した代表的な結果を示す.

Introduction

生体分子変位は、関連する生物学的機能のメカニズムを研究する上で基本的なパラメータである。1つの特定の例は、リボソーム転位1、2、その間にリボソームがメッセンジャーRNA(mRNA)上で正確に3つのヌクレオチド(nt)によって、および1つ、2つ、または3を除くntの他の数によって移動する。フレームシフト。したがって、異なるステップサイズを区別するために、分子定規システムシングルNT分解能が必要です。より大きな課題は、入口側と出口側の両方でリボソームの動きを調べ取ることです。言い換えれば、デュアルルーラーシステムでのみ、mRNAがリボソームを通してスムーズに通付けされているのか、または両側が異なるステップサイズを持ち、内側のmRNAの立体構造を引き起こしているのかを明らかにすることができます。リボソーム。

リボソームの出口側(mRNAの3’末端)の異なるステップを解決する最初の課題に対処するために、いくつかの方法が開発されました。デュアルルシフェラーゼアッセイは、得られた異なるタンパク質3、4の比率を測定することによって、異なる読み取りフレームを解決します。これは、mRNAの3’末端にのみ適用可能であり、したがって、転位の全体像を提供するには不十分です。質量分析は、対応するコード再配置5の結果として異なるペプチド断片を分析することができる。しかし、リボソームがmRNA上でどれだけのntを動かすかを特定することはできません。つま先印刷アッセイは、3′-遠位端でプライミングされた逆転写酵素を使用して、リボソーム6に向かってmRNAを転写するもう一つの一般的な方法である。しかし、リボソームに入っているmRNAの5’末端には適用できない。単一分子アプローチおよび蛍光法7を含む他の技術は、単一nt分解能を達成することは困難である。

我々は、リボソーム-mRNA複合体における未発見のmRNAの入り口と出口位置の両方を一意に決定できるデュアルDNA定規アッセイを開発した。 定規DNAは、mRNAのどちらの端に関係なく、リボソームによって発見されたmRNAと一定数の塩基対(bp)の二重鎖を形成するDNAオリゴマーである。bp番号は転移の間にmRNAのリボソームの位置を正確に明らかにする。二重鎖のbp数は、力誘発残留磁化分光法(FIRMS)8から得られた重要な解離力によって決定される。2-3 pN力の不確実性では、臨界力は単一nt分解能を提供するのに十分である。DNA定規にリンカー分子を実装することにより、リボソームによるmRNAの立体的に妨げられた側をプローブすることができる。異なるリボソーム変位は、したがって正確に解決することができる。我々は、転移9の間に抗生物質によって捕らえられたmRNAのユニークなループされた立体構造を明らかにし、滑りやすいmRNA配列10上で共存した異なる読み取りフレームを解決した。この記事では、リボソーム複合体の調製、ガラススライドの表面機能化、リボソーム複合体の固定化、磁気標識されたDNA定規によるハイブリダイゼーションを含むデュアルルーラーアッセイの詳細について説明します。分子、磁気検出、およびフォーススペクトル分析を行います。

Protocol

1. リボソーム複合体の調製 20 mMトリス-HCl(pH 7.5)、10 mM Mg(OAc)2、30 mM NH4Cl、70 mM KCl、5 mM EDTA、7 mM BME(2-メルカプトエタノール)、および0.05%Tween20で構成されるTAM10バッファの1,000 mLを作ります。 表 1に示す 5 つの混合物を準備します。注:リボソームはMRE600株11からであった。EF-Tu:伸び係数サーモ不安定。EF-Ts:伸び因子サーモ安定。GTP: …

Representative Results

図1は、主要成分の検出スキームと写真を示す。磁気検出は、走査方式(図1A)13を用いて原子磁力計によって達成される。サンプルは線形モーターに取付けられる棒の上に置かれる。モーターは磁気シールドの中の原子センサーにサンプルを運び、それから荷を下すために元の場所に戻る。原子磁力計は、サンプルスキ?…

Discussion

私たちのデュアル定規アッセイでは、磁気ビーズは2つの重要な役割を果たしています。まず、遠心力は浮力質量に比例するため、力トランスデューサとして機能します。第二に、ビーズは、現在最も正確な磁気センサである原子磁力計によって検出された信号キャリアです。機械的操作と磁気検出を組み合わせることで、DNA定規の基礎となる重要な解離力に基づいて多数の分子相互作用を解…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、米国国立衛生研究所(R01GM111452、Y.W.、S.X.)によってサポートされています。Y. W. ウェルチ財団(E-1721)からの支援を認めます。

Materials

Styrene Strip City of Industry MS-861
Glass slides Evaporated Coatings 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3
Acetic acid Millipore Sigma A6283-500ML
3-Aminopropyltriethoxysilane UCT specialties 21400088
mPEG-SVA Laysan Bio 154-82
Biotin-PEG-SVA Laysan Bio 152-84
Sodium bicarbonate Millipore Sigma S5761-500G
Epoxy glue Devcon 31345
Streptavidin ThermoFisher 434301
Fusidic Acid Millipore Sigma F0756-1G
Neomycin Sulfate Millipore Sigma 1458009
Viomycin Sulfate Millipore Sigma 1715000
Hygromycin invitrogen 10687-010
Tris-HCl Millipore Sigma T5941-100G
Magnesium acetate Millipore Sigma M5661-50G
Ammonium chloride Millipore Sigma A9434-500G
Potassium chloride Millipore Sigma P9333-500G
EDTA GIBCO 774750
2-mercaptoethanol Millipore Sigma M6250-500ML
Tween20 Millipore Sigma P1379-250ML
GTP Millipore Sigma G8877-100MG
PEP Millipore Sigma P7127-100MG
Pyruvate Kinase Millipore Sigma P1506-5KU
Sucrose  Millipore Sigma S7903-5KG
Dynabeads M-280 Streptavidin ThermoFisher 11205D
mRNA Oligo Integrated DNA Technologies 133899727 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 157468630 3ʹ- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5ʹ 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 164845370 3ʹ-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 157468628 3ʹ-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 163472705 3ʹ-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 138678130 3ʹ-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 138678131 3ʹ-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 138678132 3ʹ-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5ʹ 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 138678133 3ʹ-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ 
Centrifuge Eppendorf 5427R
Micro Ultracentrifuge Hitachi CS150FNX
Vortex mixer VWR VM-3000
Lock-in Amplifier Stanford Research Systems SR530
Lock-in Amplifier Stanford Research Systems SR830
Laser Newport TLB-6918-D
Function generator Stanford Research Systems DS345
Photo detectors Thorlabs DET36A

References

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Cite This Article
Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution. J. Vis. Exp. (149), e59918, doi:10.3791/59918 (2019).

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