単一ヌクレオチド分解能を持つリボソーム転移のメカニズムを研究するデュアルDNA定規

生体分子変位は、関連する生物学的機能のメカニズムを研究する上で基本的なパラメータである。1つの特定の例は、リボソーム転位1、2、その間にリボソームがメッセンジャーRNA(mRNA)上で正確に3つのヌクレオチド(nt)によって、および1つ、2つ、または3を除くntの他の数によって移動する。フレームシフト。したがって、異なるステップサイズを区別するために、分子定規システムシングルNT分解能が必要です。より大きな課題は、入口側と出口側の両方でリボソームの動きを調べ取ることです。言い換えれば、デュアルルーラーシステムでのみ、mRNAがリボソームを通してスムーズに通付けされているのか、または両側が異なるステップサイズを持ち、内側のmRNAの立体構造を引き起こしているのかを明らかにすることができます。リボソーム。

リボソームの出口側(mRNAの3’末端)の異なるステップを解決する最初の課題に対処するために、いくつかの方法が開発されました。デュアルルシフェラーゼアッセイは、得られた異なるタンパク質3、4の比率を測定することによって、異なる読み取りフレームを解決します。これは、mRNAの3’末端にのみ適用可能であり、したがって、転位の全体像を提供するには不十分です。質量分析は、対応するコード再配置5の結果として異なるペプチド断片を分析することができる。しかし、リボソームがmRNA上でどれだけのntを動かすかを特定することはできません。つま先印刷アッセイは、3′-遠位端でプライミングされた逆転写酵素を使用して、リボソーム6に向かってmRNAを転写するもう一つの一般的な方法である。しかし、リボソームに入っているmRNAの5’末端には適用できない。単一分子アプローチおよび蛍光法7を含む他の技術は、単一nt分解能を達成することは困難である。

我々は、リボソーム-mRNA複合体における未発見のmRNAの入り口と出口位置の両方を一意に決定できるデュアルDNA定規アッセイを開発した。 定規DNAは、mRNAのどちらの端に関係なく、リボソームによって発見されたmRNAと一定数の塩基対(bp)の二重鎖を形成するDNAオリゴマーである。bp番号は転移の間にmRNAのリボソームの位置を正確に明らかにする。二重鎖のbp数は、力誘発残留磁化分光法(FIRMS)8から得られた重要な解離力によって決定される。2-3 pN力の不確実性では、臨界力は単一nt分解能を提供するのに十分である。DNA定規にリンカー分子を実装することにより、リボソームによるmRNAの立体的に妨げられた側をプローブすることができる。異なるリボソーム変位は、したがって正確に解決することができる。我々は、転移9の間に抗生物質によって捕らえられたmRNAのユニークなループされた立体構造を明らかにし、滑りやすいmRNA^配列10上で共存した異なる読み取りフレームを解決した。この記事では、リボソーム複合体の調製、ガラススライドの表面機能化、リボソーム複合体の固定化、磁気標識されたDNA定規によるハイブリダイゼーションを含むデュアルルーラーアッセイの詳細について説明します。分子、磁気検出、およびフォーススペクトル分析を行います。