حكام الحمض النووي المزدوج لدراسة آلية نقل ريبوسم مع قرار النيوكليوتيد واحد
Summary
تم تطوير فحص حاكم الحمض النووي المزدوج لتحديد موقف mRNA أثناء نقل الريبوسوم، والذي يعتمد على قوى التفكك من الدوبلكس الحمض النووي-mRNA شكلت. مع قرار النيوكليوتيد واحد والقدرة على الوصول إلى طرفي mRNA، فإنه يمكن أن توفر رؤى ميكانيكية لنقل الريبوسوم والتحقيق في غيرها من الإزاحات حمض نووي.
Abstract
يشير النقل الريبوسوم إلى حركة ريبوسومال على الحمض النووي الريبي من قبل ثلاثة نيوكليوتيدات بالضبط (nt)، والتي هي الخطوة المركزية في تخليق البروتين. وللتحقيق في آليتها، هناك شرطان تقنيان أساسيان. الأول هو دقة واحدة nt التي يمكن حل النقل العادي من frameshifting، خلالها يتحرك ريبوسوم من قبل غير 3 nt. والثاني هو القدرة على التحقيق في كل من مدخل وخروج الجانبين من mRNA من أجل توضيح الصورة الكاملة للتبديل. نقوم بالإبلاغ عن فحص مسطرة الحمض النووي المزدوج الذي يقوم على قوى التفكك الحرجة للثنائيات الحمض النووي-mRNA، التي تم الحصول عليها عن طريق مطيافية مغنطة بقايا الناجمة عن القوة (FIRMS). مع دقة قوة 2-4 pN، يكفي تحليل المسطرة المزدوجة للتمييز بين خطوات النقل المختلفة. من خلال تنفيذ رابط طويل على DNAs التحقيق، فإنها يمكن أن تصل إلى mRNA على الجانب الآخر من ريبوسم، بحيث يمكن تحديد موقف mRNA لكلا الجانبين. ولذلك، فإن اختبار المسطرة المزدوجة هو مناسبة بشكل فريد للتحقيق في نقل الريبوسوم، وحركة الحمض النووي بشكل عام. نعرض النتائج التمثيلية التي أشارت إلى مطابقة mRNA يحلق وحل النقل الطبيعي من frameshifting.
Introduction
الإزاحة الجزيئية الحيوية هي معلمة أساسية في دراسة آلية الوظائف البيولوجية ذات الصلة. مثال واحد معين هو نقل ريبوسوم1،2، خلالها يتحرك ريبوسوم من قبل بالضبط ثلاثة نيوكليوتيدات (NT) على الحمض النووي الريبي رسول (mRNA) عادة، وواحد، اثنين، أو أرقام أخرى من NT باستثناء ثلاثة في حالة تحول الإطار. لذلك، مطلوب نظام مسطرة جزيئية دقة واحدة nt التمييز بين أحجام خطوة مختلفة. والتحدي الأكبر هو التحقيق في حركة ريبوسوم على جانبي المدخل والخروج على حد سواء. وبعبارة أخرى، فقط مع نظام حاكم مزدوج سوف نكون قادرين على الكشف عما إذا كان يتم مترابطة بسلاسة من خلال الريبوسوم، أو هناك خطوات وسيطة فيها الجانبين لديهم أحجام خطوة مختلفة مما يؤدي إلى التشابك مع mRNA المتشابكة أو حلقات داخل الريبوسم.
وقد وضعت عدة طرق لمواجهة التحدي الأول المتمثل في حل خطوات مختلفة على جانب الخروج من الريبوسوم (نهاية 3′ من mRNA). والقول المزدوج لوسيفيراز حل إطارات القراءة المختلفة عن طريق قياس نسب البروتينات المختلفة الناتجة3،4. هو فقط قابل للتطبيق ل ال 3′ نهاية من ال [مرنا] ولذلك غير كاف أن يزوّد صورة كاملة من [ترنسّس]. قياس الطيف الكتلي يمكن تحليل شظايا الببتيد المختلفة نتيجة لإعادة ترتيب التعليمات البرمجية المقابلة5. ولكن لا يمكن تحديد عدد nt التحركات ريبوسيوم على mRNA. فحص الطباعة باصبع القدم هو طريقة شائعة أخرى تستخدم نسخة عكسية تستعد في نهاية 3′-القاصية لنسخ mRNA نحو ريبوسم6. ومع ذلك، فإنه لا ينطبق على نهاية 5 ‘من mRNA التي تدخل ريبوسوم. تقنيات أخرى, بما في ذلك نهج جزيءواحد وأساليب الفلورة 7, من الصعب تحقيق قرار واحد NT.
لقد قمنا بتطوير اختبار مسطرة الحمض النووي المزدوج الذي يمكن أن يحدد بشكل فريد كل من مواقع المدخل والخروج من mRNA المكشوفة في مجمعات ريبوسوم-ميرنا. المسطرة [دنس] [دنا] [دنا] [أوليتغورس] أنّ يشكّل [دوبلكسس] من أرقام مؤكّدة من أزواج أساسيّة ([بب]) مع ال [مرنا] يكشف ب ال [ريبوسم], [رغردلوف] أيّ نهاية من ال [مرنا]. ثم تكشف أرقام BP على وجه التحديد موقف ريبوسم على mRNA أثناء النقل. يتم تحديد أرقام BP من الدوبلكس من قبل قوى التفكك الحرجة التي تم الحصول عليها من مطيافية المغناطيسية بقايا الناجمة عن القوة (FIRMS)8. مع عدم اليقين قوة 2-3 pN، والقوى الحرجة كافية لتقديم قرار واحد NT. من خلال تنفيذ جزيء الرابط على حكام الحمض النووي، يمكن التحقيق في الجانب الذي يعوقه بشكل معقم من mRNA من قبل ريبوسم. وبالتالي يمكن حل الإزاحات الريبوسومية المختلفة بدقة. لقد كشفنا بنجاح عن مطابقة حلقات فريدة من نوعها من mRNA المحاصرين بالمضادات الحيوية خلال نقل9، وحل إطارات القراءة المختلفة التي تتعايش على تسلسل mRNA زلق10. يصف هذا مادة التفاصيل من المزدوجة مسطرة فحص, أيّ يتضمّن تحضير من المجمعات [ريبوسم], سطح وظيفيّة من الشرائح زجاجيّة, يشلّ من المجمعات [ريبوسم] وهبهادهم مع مسطرة [دنا] مسمى مغناطيسيّا الجزيئات، والكشف المغناطيسي، وتحليل الطيف القوة من قبل FIRMS.
Protocol
Representative Results
Discussion
في فحص الحاكم المزدوج لدينا، والخرز المغناطيسي تلعب دورين أساسيين. أولا، أنها تعمل بمثابة محولات القوة لأن قوة الطرد المركزي يتناسب مع كتلتهم المزدهرة. ثانيا، الخرز هي ناقلات الإشارات التي تم الكشف عنها بواسطة مقياس مغناطيسي ذري، والذي هو حاليا جهاز الاستشعار المغناطيسي الأكثر دقة. الجم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة (R01GM111452، Y.W.، S.X.). ي. و. تعترف بالدعم المقدم من مؤسسة ويلش (E-1721).
Materials
| Styrene Strip | City of Industry | MS-861 | |
| Glass slides | Evaporated Coatings | 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3 | |
| Acetic acid | Millipore Sigma | A6283-500ML | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | UCT specialties | 21400088 | |
| mPEG-SVA | Laysan Bio | 154-82 | |
| Biotin-PEG-SVA | Laysan Bio | 152-84 | |
| Sodium bicarbonate | Millipore Sigma | S5761-500G | |
| Epoxy glue | Devcon | 31345 | |
| Streptavidin | ThermoFisher | 434301 | |
| Fusidic Acid | Millipore Sigma | F0756-1G | |
| Neomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1458009 | |
| Viomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1715000 | |
| Hygromycin | invitrogen | 10687-010 | |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941-100G | |
| Magnesium acetate | Millipore Sigma | M5661-50G | |
| Ammonium chloride | Millipore Sigma | A9434-500G | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P9333-500G | |
| EDTA | GIBCO | 774750 | |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-500ML | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-250ML | |
| GTP | Millipore Sigma | G8877-100MG | |
| PEP | Millipore Sigma | P7127-100MG | |
| Pyruvate Kinase | Millipore Sigma | P1506-5KU | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S7903-5KG | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | ThermoFisher | 11205D | |
| mRNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 133899727 | 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468630 | 3ʹ- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5ʹ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 164845370 | 3ʹ-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468628 | 3ʹ-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 163472705 | 3ʹ-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678130 | 3ʹ-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678131 | 3ʹ-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678132 | 3ʹ-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5ʹ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678133 | 3ʹ-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| Centrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Micro Ultracentrifuge | Hitachi | CS150FNX | |
| Vortex mixer | VWR | VM-3000 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR530 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR830 | |
| Laser | Newport | TLB-6918-D | |
| Function generator | Stanford Research Systems | DS345 | |
| Photo detectors | Thorlabs | DET36A |
References
- Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA. Quarterly Review of Biophysics. 50, 12 (2017).
- Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation. Science. 345, 1188-1191 (2014).
- Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA. 4, 479-486 (1998).
- Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).
- Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160, 870-881 (2015).
- Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Research. 38, 15 (2010).
- Chen, J., et al. Dynamic pathways of -1 translational frameshifting. Nature. 512, 328-332 (2014).
- De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA. Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).
- Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers reveal an “mRNA looping” intermediate state during ribosome translocation. RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).
- Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. High-efficiency “-1” and “-2” ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).
- Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).
- Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance. Optics Letters. 35, 661-663 (2010).
- Yao, L., Xu, S. Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).
- Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics. Physical Biology. 5, 046005 (2008).
- Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
- Jacks, T., et al. Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression. Nature. 331, 280-283 (1988).
- Schuwirth, B. S., et al. Structures of the bacterial ribosome at 3.5 Å resolution. Science. 310, 827-834 (2005).
- Jia, H., Wang, Y., Xu, S. Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps. Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).
