שליטי ה-DNA כפול ללמוד את המנגנון של טרנסלוקציה הריבוכמה עם פתרון יחיד נוקלאוטיד
Summary
שיטת ה-DNA כפול מפותחת כדי לקבוע את מיקום mRNA במהלך הריבוטרנסלוקציה, אשר נשענת על כוחות הדיסוציאציה של דופלקסים DNA-mRNA הנוצר. עם יחיד-נוקלאוטיד החלטה ויכולת להגיע שני הקצוות של mRNA, זה יכול לספק תובנות מכניסטיות עבור טרנסלוקציה ריבוכמה ולחקור אחרים חומצות גרעין displacements.
Abstract
הריבוכמה הטרנסלוקציה מתייחסת לתנועה הריבוזומלית ב-mRNA על-ידי שלושה נוקלאוטידים בדיוק (nt), שהוא השלב המרכזי בסינתזה של חלבונים. כדי לחקור את מנגנון המנגנון, קיימות שתי דרישות טכניות חיוניות. ראשית, רזולוציה בודדת של nt שיכולה לפתור טרנסלוקציה רגילה מ-frameshifting, שבמהלכה הריבוכמה נע על-ידי אחר מ-3 nt. השני הוא היכולת לחקור הן את צדי הכניסה והיציאה של mRNA כדי להבהיר את התמונה כולה של טרנסלוקציה. אנו מדווחים על שיטת ה-DNA הכפולה המבוססת על כוחות הדיסוציאציה הקריטיים של הדופלקסים של DNA-mRNA, המתקבל על ידי שריד מגנטיזציה מגנטית שארית (חברות). עם 2-4 ברזולוציה הכוח pN, הבחינה הסרגל כפול הוא מספיק כדי להבדיל בין שלבי הטרנסלוקציה שונים. על ידי יישום מקשר ארוך על DNAs בדיקה, הם יכולים להגיע mRNA בצד הנגדי של ריבוכמה, כך מיקום mRNA יכול להיקבע עבור שני הצדדים. לכן, השיטת הסרגל הכפולה מתאימה באופן ייחודי לחקירת הטרנסלוקציה הריבומוגית, ולתנועת חומצת גרעין באופן כללי. אנו מראים תוצאות הנציג אשר הצביעו על mRNA בלולאה היווצרות ונפתר טרנסלוקציה נורמלית מ frameshifting.
Introduction
עקירה ביוקולולקולרית היא פרמטר בסיסי בלימוד המנגנון של הפונקציות הביולוגיות הקשורות. דוגמה אחת היא הריבוכמה טרנסלוקציה1,2, שבמהלכה הריבוכמה נע על ידי שלושה נוקלאוטידים בדיוק (nt) על שליח RNA (mrna) בדרך כלל, ועל ידי אחד, שניים, או מספר אחר של nt מלבד שלושה במקרה של frameshifting. לפיכך, נדרשת רזולוציה יחידה של מערכת שליטה בסרגל מולקולרי כדי להבדיל בין גודלי השלבים השונים. אתגר גדול יותר הוא לחקור את התנועה הריבוחלק הן על הכניסה והן בצד היציאה. במילים אחרות, רק עם מערכת סרגל כפול נוכל לגלות אם mrna הוא משורשר בצורה חלקה דרך ריבוכמה, או יש שלבי ביניים שבו שני הצדדים יש גדלים צעד שונה המוביל לתוך מקוטע או בלולאה mrna היווצרות בפנים ה ריבוזום.
מספר שיטות פותחו כדי להתמודד עם האתגר הראשון של פתרון צעדים שונים בצד היציאה של ריבוחלק (3 ‘ הקצה של mRNA). השיטת לוציפראז כפולה פותרת את מסגרות הקריאה השונות על-ידי מדידת היחס בין החלבונים השונים הנובעים ממנה3,4. היא ישימה רק עבור 3 ‘ סוף mRNA ובכך מספיק כדי לספק תמונה מלאה של טרנסלוקציה. ספקטרומטר מסה יכול לנתח את שברי הפפטיד השונים כתוצאה מסידור הקוד המקביל5. אבל זה לא יכול להצביע על כמה nt הריבוכמה נע על mRNA. שיטת ההדפסה הבוהן היא שיטה נפוצה נוספת המשתמשת בטרנסקריפטאז הפוכה שהייתה מועלת ב -3 ‘-הסוף כדי לתעתור את ה-mRNA לקראת הריבוחלק6. עם זאת, היא אינה ישימה עבור 5 ‘ סוף mRNA כי הוא להזין את ריבוכמה. טכניקות אחרות, כולל גישות מולקולה יחידה ושיטות זריחה7, קשה להשיג רזולוציה בודדת-nt.
פיתחנו את שיטת ה-DNA כפול שניתן לקבוע באופן ייחודי הן את מיקומי הכניסה והיציאה של mRNA החשופה ב-מכלולי הריבוכמה-mRNA. DNAs הסרגל הם ה-DNA oligomers שיוצרים דופלקסים של מספר מסוים של זוגות בסיס (bp) עם mRNA חשף על ידי הריבוכמה, ללא קשר לאיזה קצה של mRNA. מספרי bp ולאחר מכן בדיוק לחשוף את מיקום הריבוכמה על mRNA במהלך הטרנסלוקציה. מספרי הלחץ של הדופלקסים נקבעים על ידי כוחות הדיסוציאציה הקריטיים שלהם, שהתקבלו מהספקטרוסקופיית מגנטיזציה (חברות)8. עם 2-3 בחוסר ודאות כוח, הכוחות הקריטיים מספיקים כדי להציע רזולוציה בודדת nt. על-ידי יישום מולקולת מקשר על שליטי ה-DNA, הצד הפריע באופן שחור של mRNA על ידי הריבוכמה ניתן לנחקר. הריבוזומdisplacements שונים יכולים ובכך להיפתר במדויק. הצלחנו לחשוף בהצלחה היווצרות בלולאה ייחודית של mRNA לכוד על ידי אנטיביוטיקה במהלך הטרנסלוקציה9, ופתרו מסגרות קריאה שונות שנוצרו ברצף mrna חלקלק10. מאמר זה מתאר את הפרטים של מערך הסרגל הכפול, הכולל הכנת מכלולי ריבוכמה, הפונקציונליות של פני השטח של שקופיות הזכוכית, השתק של מכלולי ריבוכמה והכלאה שלהם עם השליט DNA מגנטית מתויג מולקולות, זיהוי מגנטי וניתוח ספקטרום הכוח של חברות משרדי.
Protocol
Representative Results
Discussion
בתוך השליטה הכפולה שלנו, החרוזים המגנטיים לשחק שני תפקידים חיוניים. ראשית, הם משמשים ככוח התמרה כי הכוח הצנטריפוגלי הוא יחסי למסה הפרוע שלהם. שנית, החרוזים הם נושאות איתותים שזוהו על ידי מגנטומטר אטומי, שכרגע הוא החיישן המגנטי המדויק ביותר. שילוב מניפולציה מכנית וזיהוי מגנטי, שיטת המשרדים …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי האמריקאי לבריאות (R01GM111452, י, S.X.). י. ו. מאשר תמיכה מקרן וולש (E-1721).
Materials
| Styrene Strip | City of Industry | MS-861 | |
| Glass slides | Evaporated Coatings | 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3 | |
| Acetic acid | Millipore Sigma | A6283-500ML | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | UCT specialties | 21400088 | |
| mPEG-SVA | Laysan Bio | 154-82 | |
| Biotin-PEG-SVA | Laysan Bio | 152-84 | |
| Sodium bicarbonate | Millipore Sigma | S5761-500G | |
| Epoxy glue | Devcon | 31345 | |
| Streptavidin | ThermoFisher | 434301 | |
| Fusidic Acid | Millipore Sigma | F0756-1G | |
| Neomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1458009 | |
| Viomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1715000 | |
| Hygromycin | invitrogen | 10687-010 | |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941-100G | |
| Magnesium acetate | Millipore Sigma | M5661-50G | |
| Ammonium chloride | Millipore Sigma | A9434-500G | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P9333-500G | |
| EDTA | GIBCO | 774750 | |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-500ML | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-250ML | |
| GTP | Millipore Sigma | G8877-100MG | |
| PEP | Millipore Sigma | P7127-100MG | |
| Pyruvate Kinase | Millipore Sigma | P1506-5KU | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S7903-5KG | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | ThermoFisher | 11205D | |
| mRNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 133899727 | 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468630 | 3ʹ- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5ʹ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 164845370 | 3ʹ-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468628 | 3ʹ-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 163472705 | 3ʹ-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678130 | 3ʹ-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678131 | 3ʹ-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678132 | 3ʹ-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5ʹ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678133 | 3ʹ-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| Centrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Micro Ultracentrifuge | Hitachi | CS150FNX | |
| Vortex mixer | VWR | VM-3000 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR530 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR830 | |
| Laser | Newport | TLB-6918-D | |
| Function generator | Stanford Research Systems | DS345 | |
| Photo detectors | Thorlabs | DET36A |
References
- Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA. Quarterly Review of Biophysics. 50, 12 (2017).
- Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation. Science. 345, 1188-1191 (2014).
- Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA. 4, 479-486 (1998).
- Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).
- Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160, 870-881 (2015).
- Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Research. 38, 15 (2010).
- Chen, J., et al. Dynamic pathways of -1 translational frameshifting. Nature. 512, 328-332 (2014).
- De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA. Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).
- Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers reveal an “mRNA looping” intermediate state during ribosome translocation. RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).
- Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. High-efficiency “-1” and “-2” ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).
- Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).
- Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance. Optics Letters. 35, 661-663 (2010).
- Yao, L., Xu, S. Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).
- Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics. Physical Biology. 5, 046005 (2008).
- Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
- Jacks, T., et al. Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression. Nature. 331, 280-283 (1988).
- Schuwirth, B. S., et al. Structures of the bacterial ribosome at 3.5 Å resolution. Science. 310, 827-834 (2005).
- Jia, H., Wang, Y., Xu, S. Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps. Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).
