O ensaio duplo da régua do ADN é desenvolvido para determinar a posição do mRNA durante a translocação Ribossoma, que confia nas forças da dissociação dos duplexes dados forma do ADN-mRNA. Com a definição e a capacidade single-nucleotide de alcangar ambas as extremidades do mRNA, pode fornecer introspecções mecanicista para o translocação e a sonda Ribossoma outros deslocamentos do ácido nucleico.
A translocação Ribossome refere-se ao movimento ribossômico no mRNA por exatamente três nucleotídeos (NT), que é o passo central na síntese proteica. Para investigar o seu mecanismo, existem dois requisitos técnicos essenciais. Primeiro é a resolução de NT único que pode resolver translocação normal de frameshifting, durante o qual o Ribossome move por outros de 3 NT. A segunda é a capacidade de sonda tanto os lados de entrada e saída do mRNA, a fim de elucidar todo o quadro de translocação. Nós relatamos o ensaio duplo da régua do ADN que é baseado nas forças críticas da dissociação de duplexes do ADN-mRNA, obtidos pela espectroscopia de magnetização remanescente força-induzida (FIRMAS). Com resolução de força de 2-4 pN, o ensaio de régua dupla é suficiente para distinguir diferentes etapas de translocação. Implementando um linker longo nos DNAs de sondagem, podem alcangar o mRNA no lado oposto do ribosome, de modo que a posição do mRNA possa ser determinada para ambos os lados. Conseqüentemente, o ensaio duplo da régua é serido excepcionalmente para investigar a translocação Ribossoma, e o movimento ácido nucleico geralmente. Nós mostramos resultados representativos que indicaram um conformação em loop do mRNA e resolveram o translocação normal do frameshifting.
O deslocamento Biomolecular é um parâmetro fundamental no estudo do mecanismo das funções biológicas relacionadas. Um exemplo particular é o translocação Ribossome1,2, durante que o ribossoma se move por exatamente três nucleotídeos (NT) no RNA do mensageiro (mRNA) normalmente, e por um, dois, ou outros números de NT exceto três no caso de ribossômica. Conseqüentemente, uma definição do único-NT do sistema da régua molecular é exigida para distinguir os tamanhos diferentes da etapa. Um desafio maior é sondar o movimento Ribossome nos lados da entrada e da saída. Em outras palavras, somente com um sistema de régua dupla seremos capazes de revelar se o mRNA é suavemente rosqueado através do Ribossome, ou há etapas intermediárias em que os dois lados têm tamanhos de etapa diferentes levando a uma conformação de mRNA tornada ou em loop dentro do Ribossoma.
Vários métodos foram desenvolvidos para abordar o primeiro desafio de resolver diferentes passos no lado de saída do Ribossome (o 3 ‘ fim do mRNA). O ensaio de luciferase dupla resolve os diferentes quadros de leitura medindo as proporções das diferentes proteínas resultantes3,4. Só é aplicável para o 3 ‘ fim do mRNA e, portanto, insuficiente para fornecer um quadro completo de translocação. A espectrometria de massas pode analisar os diferentes fragmentos de peptídeos como consequência dos rearranjos de código correspondentes5. Mas não pode apontar a quantos NT o ribossoma movimentos no mRNA. O teste Toe-Printing é outro método comum que usa uma transcriptase reversa preparada na extremidade 3 ‘-distal para transacir o mRNA em direção ao Ribossome6. No entanto, não é aplicável para o 5 ‘ fim do mRNA que está entrando no Ribossome. Outras técnicas, incluindo abordagens de molécula única e métodos de fluorescência7, são difíceis de alcançar a resolução de NT único.
Nós desenvolvemos o ensaio duplo da régua do ADN que pode excepcionalmente determinar as posições da entrada e da saída do mRNA descoberto em complexos de ribosome-mRNA. Os DNAs da régua são oligômeros do ADN que formam duplex de determinados números dos emparelhadas (BP) com o mRNA descoberto pelo ribosome, não obstante que extremidade do mRNA. Os números BP então revelam precisamente a posição Ribossome no mRNA durante a translocação. Os números de BP dos duplex são determinados por suas forças críticas da dissociação obtidas da espectroscopia de magnetização remanescente induzida pela força (firmas)8. Com a incerteza da força de 2-3 pN, as forças críticas são suficientes para oferecer a definição do único-NT. Implementando uma molécula do linker nas réguas do ADN, o lado aberta impedido do mRNA pelo Ribossoma pode ser sonhado. Os deslocamentos ribosomal diferentes podem assim ser resolvidos exatamente. Nós revelamos com sucesso um conformação em loop original do mRNA prendido por antibióticos durante o translocação9, e os frames de leitura diferentes resolvidos que coexistiram em uma seqüência escorregadia do mRNA10. Este artigo descreve os detalhes do ensaio duplo da régua, que incluem a preparação dos complexos Ribossoma, a funcionalização de superfície das corrediças de vidro, a imobilização dos complexos Ribossoma e sua hibridação com a régua magneticamente etiquetada do ADN moléculas, detecção magnética e análise do espectro de força por empresas.
Em nosso ensaio duplo da régua, os grânulos magnéticos jogam dois papéis essenciais. Primeiro, eles servem como os transdutores de força porque a força centrífuga é proporcional à sua massa flutuante. Em segundo lugar, os grânulos são portadores do sinal detectados por um magnetometer atômico, que seja atualmente o sensor magnético o mais exato. Combinando manipulação mecânica e detecção magnética, a técnica de empresas é capaz de resolver um grande número de interações moleculares com base em sua…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho é apoiado pelos institutos nacionais de saúde dos EUA (R01GM111452, Y.W., S.X.). Y. W. reconhece o apoio da Fundação Welch (E-1721).
Styrene Strip | City of Industry | MS-861 | |
Glass slides | Evaporated Coatings | 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3 | |
Acetic acid | Millipore Sigma | A6283-500ML | |
3-Aminopropyltriethoxysilane | UCT specialties | 21400088 | |
mPEG-SVA | Laysan Bio | 154-82 | |
Biotin-PEG-SVA | Laysan Bio | 152-84 | |
Sodium bicarbonate | Millipore Sigma | S5761-500G | |
Epoxy glue | Devcon | 31345 | |
Streptavidin | ThermoFisher | 434301 | |
Fusidic Acid | Millipore Sigma | F0756-1G | |
Neomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1458009 | |
Viomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1715000 | |
Hygromycin | invitrogen | 10687-010 | |
Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941-100G | |
Magnesium acetate | Millipore Sigma | M5661-50G | |
Ammonium chloride | Millipore Sigma | A9434-500G | |
Potassium chloride | Millipore Sigma | P9333-500G | |
EDTA | GIBCO | 774750 | |
2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-500ML | |
Tween20 | Millipore Sigma | P1379-250ML | |
GTP | Millipore Sigma | G8877-100MG | |
PEP | Millipore Sigma | P7127-100MG | |
Pyruvate Kinase | Millipore Sigma | P1506-5KU | |
Sucrose | Millipore Sigma | S7903-5KG | |
Dynabeads M-280 Streptavidin | ThermoFisher | 11205D | |
mRNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 133899727 | 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ |
DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468630 | 3ʹ- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5ʹ |
DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 164845370 | 3ʹ-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ |
DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468628 | 3ʹ-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ |
DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 163472705 | 3ʹ-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ |
DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678130 | 3ʹ-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678131 | 3ʹ-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678132 | 3ʹ-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5ʹ |
DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678133 | 3ʹ-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
Centrifuge | Eppendorf | 5427R | |
Micro Ultracentrifuge | Hitachi | CS150FNX | |
Vortex mixer | VWR | VM-3000 | |
Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR530 | |
Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR830 | |
Laser | Newport | TLB-6918-D | |
Function generator | Stanford Research Systems | DS345 | |
Photo detectors | Thorlabs | DET36A |