Summary

Réguas duplas do ADN para estudar o mecanismo da translocação ribosome com a definição do único-nucleotide

Published: July 08, 2019
doi:

Summary

O ensaio duplo da régua do ADN é desenvolvido para determinar a posição do mRNA durante a translocação Ribossoma, que confia nas forças da dissociação dos duplexes dados forma do ADN-mRNA. Com a definição e a capacidade single-nucleotide de alcangar ambas as extremidades do mRNA, pode fornecer introspecções mecanicista para o translocação e a sonda Ribossoma outros deslocamentos do ácido nucleico.

Abstract

A translocação Ribossome refere-se ao movimento ribossômico no mRNA por exatamente três nucleotídeos (NT), que é o passo central na síntese proteica. Para investigar o seu mecanismo, existem dois requisitos técnicos essenciais. Primeiro é a resolução de NT único que pode resolver translocação normal de frameshifting, durante o qual o Ribossome move por outros de 3 NT. A segunda é a capacidade de sonda tanto os lados de entrada e saída do mRNA, a fim de elucidar todo o quadro de translocação. Nós relatamos o ensaio duplo da régua do ADN que é baseado nas forças críticas da dissociação de duplexes do ADN-mRNA, obtidos pela espectroscopia de magnetização remanescente força-induzida (FIRMAS).  Com resolução de força de 2-4 pN, o ensaio de régua dupla é suficiente para distinguir diferentes etapas de translocação. Implementando um linker longo nos DNAs de sondagem, podem alcangar o mRNA no lado oposto do ribosome, de modo que a posição do mRNA possa ser determinada para ambos os lados. Conseqüentemente, o ensaio duplo da régua é serido excepcionalmente para investigar a translocação Ribossoma, e o movimento ácido nucleico geralmente. Nós mostramos resultados representativos que indicaram um conformação em loop do mRNA e resolveram o translocação normal do frameshifting.

Introduction

O deslocamento Biomolecular é um parâmetro fundamental no estudo do mecanismo das funções biológicas relacionadas. Um exemplo particular é o translocação Ribossome1,2, durante que o ribossoma se move por exatamente três nucleotídeos (NT) no RNA do mensageiro (mRNA) normalmente, e por um, dois, ou outros números de NT exceto três no caso de ribossômica. Conseqüentemente, uma definição do único-NT do sistema da régua molecular é exigida para distinguir os tamanhos diferentes da etapa. Um desafio maior é sondar o movimento Ribossome nos lados da entrada e da saída. Em outras palavras, somente com um sistema de régua dupla seremos capazes de revelar se o mRNA é suavemente rosqueado através do Ribossome, ou há etapas intermediárias em que os dois lados têm tamanhos de etapa diferentes levando a uma conformação de mRNA tornada ou em loop dentro do Ribossoma.

Vários métodos foram desenvolvidos para abordar o primeiro desafio de resolver diferentes passos no lado de saída do Ribossome (o 3 ‘ fim do mRNA). O ensaio de luciferase dupla resolve os diferentes quadros de leitura medindo as proporções das diferentes proteínas resultantes3,4. Só é aplicável para o 3 ‘ fim do mRNA e, portanto, insuficiente para fornecer um quadro completo de translocação. A espectrometria de massas pode analisar os diferentes fragmentos de peptídeos como consequência dos rearranjos de código correspondentes5. Mas não pode apontar a quantos NT o ribossoma movimentos no mRNA. O teste Toe-Printing é outro método comum que usa uma transcriptase reversa preparada na extremidade 3 ‘-distal para transacir o mRNA em direção ao Ribossome6. No entanto, não é aplicável para o 5 ‘ fim do mRNA que está entrando no Ribossome. Outras técnicas, incluindo abordagens de molécula única e métodos de fluorescência7, são difíceis de alcançar a resolução de NT único.

Nós desenvolvemos o ensaio duplo da régua do ADN que pode excepcionalmente determinar as posições da entrada e da saída do mRNA descoberto em complexos de ribosome-mRNA.  Os DNAs da régua são oligômeros do ADN que formam duplex de determinados números dos emparelhadas (BP) com o mRNA descoberto pelo ribosome, não obstante que extremidade do mRNA. Os números BP então revelam precisamente a posição Ribossome no mRNA durante a translocação. Os números de BP dos duplex são determinados por suas forças críticas da dissociação obtidas da espectroscopia de magnetização remanescente induzida pela força (firmas)8. Com a incerteza da força de 2-3 pN, as forças críticas são suficientes para oferecer a definição do único-NT. Implementando uma molécula do linker nas réguas do ADN, o lado aberta impedido do mRNA pelo Ribossoma pode ser sonhado. Os deslocamentos ribosomal diferentes podem assim ser resolvidos exatamente. Nós revelamos com sucesso um conformação em loop original do mRNA prendido por antibióticos durante o translocação9, e os frames de leitura diferentes resolvidos que coexistiram em uma seqüência escorregadia do mRNA10. Este artigo descreve os detalhes do ensaio duplo da régua, que incluem a preparação dos complexos Ribossoma, a funcionalização de superfície das corrediças de vidro, a imobilização dos complexos Ribossoma e sua hibridação com a régua magneticamente etiquetada do ADN moléculas, detecção magnética e análise do espectro de força por empresas.

Protocol

1. preparação dos complexos ribosalguns Fazer 1.000 mL de tampão TAM10, que consiste de 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM mg (OAc)2, 30 mm NH4CL, 70 mm KCl, 5 mM EDTA, 7 mm Bme (2-Mercaptoetanol), e 0, 5% Tween20. Prepare as cinco misturas indicadas na tabela 1.Nota: o Ribossome foi da cepa MRE60011. EF-tu: fator de alongamento termo instável. EF-TS: fator de alongamento Thermo estável. GTP: trifosfato de guanosina. PEP: fosho (enol)…

Representative Results

A Figura 1 mostra o esquema de detecção e as fotografias dos componentes principais. A detecção magnética é alcançada por um magnetómetro atômico utilizando o esquema de digitalização (Figura 1a)13. A amostra é colocada sobre uma haste montada em um motor linear. O motor transporta a amostra ao sensor atômico dentro de um escudo magnético, a seguir de volta ao local original para descarregar. O magnetometro …

Discussion

Em nosso ensaio duplo da régua, os grânulos magnéticos jogam dois papéis essenciais. Primeiro, eles servem como os transdutores de força porque a força centrífuga é proporcional à sua massa flutuante. Em segundo lugar, os grânulos são portadores do sinal detectados por um magnetometer atômico, que seja atualmente o sensor magnético o mais exato. Combinando manipulação mecânica e detecção magnética, a técnica de empresas é capaz de resolver um grande número de interações moleculares com base em sua…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho é apoiado pelos institutos nacionais de saúde dos EUA (R01GM111452, Y.W., S.X.). Y. W. reconhece o apoio da Fundação Welch (E-1721).

Materials

Styrene Strip City of Industry MS-861
Glass slides Evaporated Coatings 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3
Acetic acid Millipore Sigma A6283-500ML
3-Aminopropyltriethoxysilane UCT specialties 21400088
mPEG-SVA Laysan Bio 154-82
Biotin-PEG-SVA Laysan Bio 152-84
Sodium bicarbonate Millipore Sigma S5761-500G
Epoxy glue Devcon 31345
Streptavidin ThermoFisher 434301
Fusidic Acid Millipore Sigma F0756-1G
Neomycin Sulfate Millipore Sigma 1458009
Viomycin Sulfate Millipore Sigma 1715000
Hygromycin invitrogen 10687-010
Tris-HCl Millipore Sigma T5941-100G
Magnesium acetate Millipore Sigma M5661-50G
Ammonium chloride Millipore Sigma A9434-500G
Potassium chloride Millipore Sigma P9333-500G
EDTA GIBCO 774750
2-mercaptoethanol Millipore Sigma M6250-500ML
Tween20 Millipore Sigma P1379-250ML
GTP Millipore Sigma G8877-100MG
PEP Millipore Sigma P7127-100MG
Pyruvate Kinase Millipore Sigma P1506-5KU
Sucrose  Millipore Sigma S7903-5KG
Dynabeads M-280 Streptavidin ThermoFisher 11205D
mRNA Oligo Integrated DNA Technologies 133899727 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 157468630 3ʹ- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5ʹ 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 164845370 3ʹ-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 157468628 3ʹ-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 163472705 3ʹ-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 138678130 3ʹ-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 138678131 3ʹ-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 138678132 3ʹ-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5ʹ 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 138678133 3ʹ-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ 
Centrifuge Eppendorf 5427R
Micro Ultracentrifuge Hitachi CS150FNX
Vortex mixer VWR VM-3000
Lock-in Amplifier Stanford Research Systems SR530
Lock-in Amplifier Stanford Research Systems SR830
Laser Newport TLB-6918-D
Function generator Stanford Research Systems DS345
Photo detectors Thorlabs DET36A

References

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Cite This Article
Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution. J. Vis. Exp. (149), e59918, doi:10.3791/59918 (2019).

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