שיטת היווצרות טרום-סינפסה באמצעות חרוזי סדרן ותרבות "תא כדור"
Summary
היווצרות preסינפסה הוא תהליך דינמי כולל הצטברות של חלבונים סינפטית בסדר הנכון. בשיטה זו, היווצרות preסינפסה מופעלות על ידי חרוזים מצועם עם חלבון preסינפא מארגן על גיליונות סיבי של “כדור תא העצב” התרבות, כך הצטברות של חלבונים סינפטית קל להיות מנותח במהלך היווצרות preסינפסה.
Abstract
במהלך פיתוח עצבי, היווצרות סינפסה. הוא צעד חשוב להקמת מעגלים עצביים כדי ליצור סינפסות, חלבונים סינפטית חייבים להיות מסופקים בסדר המתאים על ידי הובלה של גופי תא ו/או תרגום מקומי בסינפסות בלתי ילדותית. עם זאת, זה לא באופן מלא להבין איך חלבונים סינפטית להצטבר הסינפסות בסדר הנכון. כאן, אנו מציגים שיטה הרומן לנתח היווצרות טרום סינפטיות באמצעות שילוב של תרבות כדור העצב עם חרוזים כדי לגרום להיווצרות preסינפסה. כדורי תא העצב כי הוא אגרגטים עצביים התא לספק גיליונות סיבי הרחק גופי התא ו דנדריטים, כך אותות פלורסנט חלשה של טרום הסינפסות ניתן לזהות על ידי הימנעות אותות מכריע של גופי תא. כמו חרוזים כדי להפעיל את היווצרות preסינפסה, אנו משתמשים חרוזים מצועם עם לוקיצין עשיר לחזור על הקרום העצבי 2 (LRRTM2), מארגן presynapse מדומה. באמצעות שיטה זו, הדגמנו כי מנשא גלוטמט vesicular 1 (vGlut1), חלבון שלפוחית סינפטית, שנצבר מראש מהיר יותר מאשר Munc18-1, חלבון אזור פעיל. Munc18-1 מצטבר תרגום-בהתלהבות בקדם-סינפסה גם לאחר הסרת גופי תאים. ממצא זה מצביע על הצטברות Munc18-1 על-ידי תרגום מקומי באקסונים, לא הובלה מגופי תאים. לסיכום, שיטה זו מתאימה לנתח הצטברות של חלבונים סינפטית בטרום הסינפסות ומקור של חלבונים סינפטית. כמו תרבות כדור העצב היא פשוטה ואין צורך להשתמש מכשירים מיוחדים, שיטה זו יכולה להיות ישימה פלטפורמות ניסיוני אחרים.
Introduction
היווצרות סינפסה הוא אחד מהצעדים הקריטיים במהלך פיתוח מעגלים עצביים1,2,3. היווצרות של הסינפסות כי הם תאים מיוחדים מורכב pre-לאחר הסינפסות הוא תהליך מורכב רב מעורבים הכרה מתאימה של אקסונים ו דנדריטים, היווצרות אזור פעיל צפיפות פוסט סינפטית, ויישור נאות של ערוצי יון וקולטני נוירוטרנסמיטר1,2. בכל תהליך, סוגים רבים של חלבונים סינפטית להצטבר אלה תאים מיוחדים בעיתוי הנכון על ידי הובלת חלבונים סינפטית מגופי התא ו/או על ידי תרגום מקומי בתאים. חלבונים סינפטית אלה נחשבים מסודרים באופן מאורגן כדי ליצור סינפסות תפקודית. תפקוד של כמה חלבונים סינפטיות מעורבים היווצרות סינפסה תוצאות מחלות נוירולוגיות4,5. עם זאת, זה עדיין לא ברור איך חלבונים סינפטית מצטברים בעיתוי הנכון.
כדי לחקור כיצד מצטברים חלבונים סינפטיים באופן מאורגן, יש צורך לבחון את הצטברות החלבונים הסינפטית בסדר כרונולוגי. דיווחים מסוימים הפגינו הדמיה חיה כדי לבחון את היווצרות סינפסה בתרבות המונתק של נוירונים6,7. עם זאת, זה זמן רב למצוא נוירונים אשר רק להתחיל היווצרות סינפסה תחת מיקרוסקופ. כדי להתבונן הצטברות של חלבונים סינפטית ביעילות, היווצרות סינפסה חייב להתחיל בזמן שבו החוקרים רוצים לגרום להיווצרות. האתגר השני הוא להבחין הצטברות של חלבונים סינפטית עקב הובלה של גופי תאים או תרגום מקומי בסינפסות. לצורך זה, רמת התרגום הכרחית למדידה במצב שאינו מאפשר העברה של חלבונים סינפטית מגופי התא.
פיתחנו הרומן טרום הסינפסה היווצרות באמצעות שילוב של תרבות כדור העצב עם חרוזים כדי לגרום preסינפסה היווצרות8. כדור תא העצב תרבות מפותח כדי לבחון האקסון האקאליות, בשל היווצרות של גיליונות סיבי המקיפים גופים תא9,10. השתמשנו חרוזים מגנטיים מצועם עם לוקיצין עשיר לחזור על הקרום העצבי 2 (LRRTM2) כי הוא מארגן טרום סינפטיות כדי לגרום הפרסינפסות מרגש (איור 1a)11,12,13. באמצעות חרוזי LRRTM2, היווצרות preסינפסה להתחיל בזמן כאשר החרוזים מוחלים. משמעות הדבר היא כי היווצרות preסינפסה מתחיל באלפי אקסונים של כדור עצב באותו זמן, ובכך הוא מאפשר לבחון את הזמן המדויק של הצטברות של חלבונים סינפטית ביעילות. בנוסף, התרבות כדור העצב הוא קל לחסום התחבורה חלבונים סינפטית מ סומה על ידי הסרת גופי תא (איור 1B)8. כבר אישרו כי אקסונים ללא גופים תא יכול לשרוד הם בריאים לפחות 4 h לאחר ההסרה של גופות תאים. כך, פרוטוקול זה מתאים לחקור מאיפה חלבונים סינפטיות נגזרות (גוף תא או axon), וכיצד חלבונים סינפטית להצטבר באופן מאורגן.
Protocol
Representative Results
Discussion
פיתחנו שיטה הרומן לבחון היווצרות preסינפסה מגורה עם LRRTM2-חרוזים באמצעות תרבות כדור העצב. כיום, רוב שיטת היווצרות טרום-סינפסה כוללת מחרוזות מצופות פולי-ליזין (PDL) והתרבות המונתק/חדר מיקרופלואידיג20,21,22. אחד היתרונות של שיטה זו הוא LRRTM2 חרוזים. ב…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת באופן חלקי על ידי JSPS גרנט-in-סיוע עבור מחקר מדעי (KAKENHI) (C) (מס ‘ 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki). אנו מודים לד ר טרוקקאזא נוג’י ולגב מקקיקו ניוזאקי (אונ’ יוקוהמה סיטי) באדיבות LRRTM2 חלבון biotinylated. אנו מודים גם לחונלי וואיצ’י ולרי אישיי לקבלת סיוע טכני.
Materials
| Antibody diluent | DAKO | S2022 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-585-151 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| mouse anti-Munc18-1 | BD Biosciences | 610336 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Bovine Serum Alubumin (BSA) | Nacalai Tesque | 01863-48 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish) | Nunc | 176740 | |
| Complete EDTA-free | Roche | 11873580001 | |
| cooled CCD camera | Andor Technology | iXON3 | |
| Coverslip | Matsunami | C015001 | Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI) | Nacalai Tesque | 11034-56 | |
| Deoxyribonuclease 1 (DNase I) | Wako pure chemicals | 047-26771 | |
| Expi293 Expression System | Thermo Fisher Scientific | A14635 | |
| Horse serum | Sigma-Aldrich | H1270 | |
| image acquisition software | Nikon | NIS-element AR | |
| Image analysis software | NIH | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Inverted fluorecent microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Neurobasal media | Thermo Fisher Scientific | #21103-049 | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Thermo Fisher Scientific | #143-06561 | |
| N-propyl gallate | Nacalai Tesque | 29303-92 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
Paraplast Plus |
Sigma-Aldrich | P3558 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide (MW > 300,000) | Nacalai Tesque | 28359-54 | |
| poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| Prepacked Disposable PD-10 Columns | GE healthcare | 17085101 | |
| rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1 | Synaptic Systems | 135-302 | |
| SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent) | Nacalai Tesque | 41506-04 | |
| Streptavidin-coated magnetic particles | Spherotech Inc | SVM-40-10 | diameter: 4-5 µm |
| TritonX-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Trypsin | Nacalai Tesque | 18172-94 |
References
- Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).
- Ziv, N. E., Garner, C. C. Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly. Nature Reviews Neuroscience. 5 (5), 385-399 (2004).
- Chia, P. H., Li, P., Shen, K. Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation. Journal of Cell Biology. 203 (1), 11-22 (2013).
- Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
- Saitsu, H., et al. CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia. Epilepsia. 53 (8), 1441-1449 (2012).
- Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. Assembly of New Individual Excitatory Synapses. Neuron. 27 (1), 57-69 (2000).
- Bresler, T., et al. Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (6), 1507-1520 (2004).
- Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis. Neuroscience Research. , (2018).
- Sasaki, Y., et al. Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local β-Actin Synthesis and Growth Cone Turning. Journal of Neuroscience. 30 (28), 9349-9358 (2010).
- Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons. Developmental neurobiology. 74 (3), 397-406 (2014).
- Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
- de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
- Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Hirai, H., et al. Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2. EMBO reports. , (2017).
- Yasui, N., et al. Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 35247-35256 (2011).
- Bassell, G. J., Warren, S. T. Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function. Neuron. 60 (2), 201-214 (2008).
- Darnell, J. C., Klann, E. The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS. Nat Neurosci. 16 (11), 1530-1536 (2013).
- Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome. Nature Reviews Neuroscience. 16 (10), 595-605 (2015).
- Lucido, A. L., et al. Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts. Journal of Neuroscience. 29 (40), 12449-12466 (2009).
- Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal Translation of β-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).
- Batista, A. F. R., Martínez, J. C., Hengst, U. Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals. Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).
