Presynapse oluşum assay kullanarak Presynapse Organizatör boncuk ve "neuron Ball" kültür
Summary
Presynapse oluşumu doğru sırayla sinaptik proteinlerin birikimi de dahil olmak üzere dinamik bir süreçtir. Bu yöntemle, presynapse oluşumu “nöron topu” kültürünün aktik levhalar üzerinde bir presynapse Organizatör protein ile konjuti boncuklar tarafından tetiklenir, böylece Sinapik proteinlerin birikimi presynapse oluşumu sırasında analiz edilmesi kolaydır.
Abstract
Nöronal gelişim sırasında, sinaps oluşumu nöral devreler kurmak için önemli bir adımdır. Sinapslar oluşturmak için, sinaptik proteinler hücre organları ve/veya yerel çeviri olgunlaşmamış sinapsların taşıma ile uygun sırada sağlanmalıdır. Ancak, tam olarak nasıl sinaptik proteinlerin doğru sırayla sinaps birikir anlaşılmadı. Burada, presynapse oluşumunu teşvik etmek için boncuk ile nöron top kültürünün kombinasyonunu kullanarak presimtik oluşumu analiz etmek için yeni bir yöntem sunuyoruz. Nöron hücre agregaları olan nöron topları hücre organları ve dendrites uzak aksal levhalar sağlar, böylece presynaplar zayıf floresan sinyalleri hücre organları ezici sinyalleri kaçınarak tespit edilebilir. Boncuk presynapse oluşumu tetiklemek için, biz leucine zengin tekrarlama transmembran nöronal 2 (LRRTM2), bir uyarıcı presinaptik organizatör ile konjuti boncuklar kullanın. Bu yöntemi kullanarak, biz göstermiştir ki veziküler glutamat taşıyıcı 1 (vGlut1), bir sinaptik vezirik protein, Munc18-1 daha hızlı presynapses birikmiş, aktif bir bölge protein. Munc18-1 birikmiş çeviri-güvenilir presynapse bile hücre gövdeleri kaldırdıktan sonra. Bu bulgu, hücre gövdelerini taşıma değil, akons yerel çeviri tarafından Munc18-1 birikimini gösterir. Sonuç olarak, bu yöntem presynaplar ve sinaptik proteinlerin kaynağı sinaptik proteinlerin birikimi analiz etmek için uygundur. Nöron topu kültürü basittir ve özel cihaz kullanmak gerekli değildir, bu yöntem diğer deneysel platformlar için geçerli olabilir.
Introduction
SYNAPSE oluşumu, nöral devrelerin geliştirilmesi sırasında kritik adımlardan biridir1,2,3. Ön ve post-sinapslardan oluşan özel bölmeler olan sinapsların oluşumu, akons ve dendritlerin uygun şekilde tanınması, aktif bölge ve postsinaptik yoğunluğun oluşması ve uygun şekilde hizalanması ile ilgili karmaşık ve çok adımlı bir süreçtir. iyon kanalları ve nörotransmitter reseptörleri1,2. Her süreçte, sinaptik proteinlerin birçok tür hücre organları ve/veya bölmeler yerel çeviri tarafından sinaptik proteinleri taşıyarak uygun zamanlamaya göre bu özel bölmeleri birikir. Bu sinaptik proteinler fonksiyonel sinaps oluşturmak için organize bir şekilde düzenlenmiş olarak kabul edilir. Bazı sinaptik proteinlerin disfonksiyon nörolojik hastalıklarda sinaps oluşumu sonuçları4,5. Ancak, sinaptik proteinlerin uygun zamanlamaya göre nasıl biriktiği belirsiz kalır.
Sinaptik proteinlerin organize bir şekilde nasıl birikdiğini araştırmak için sinaptik proteinleri kronolojik sırada birikmesini incelemek gerekir. Bazı raporlar,6,7‘ deki nöronlar kültüründe sinaps oluşumunu gözlemlemek için canlı görüntüleme gösterdi. Ancak, sadece mikroskopide sinaps oluşumu başlatmak nöronlar bulmak için zaman alıcı. Etkili sinaptik proteinlerin birikimini gözlemlemek için, sinaps oluşumu araştırmacılar oluşumu ikna etmek istediğinizde zaman başlamalıdır. İkinci zorluk hücre organları veya sinapslar yerel çeviri taşıma nedeniyle sinaptik proteinlerin birikimini ayırt etmektir. Bu amaçla, çeviri seviyesi hücre gövdelerini sinaptik proteinlerin taşınması izin vermez koşul altında ölçülmesi gereklidir.
Biz, presynapse oluşumu8teşvik boncuk ile nöron top kültürünün kombinasyonu kullanarak roman presynapse oluşumu tahlil geliştirdi. Nöron top kültürü, hücre gövdelerini çevreleyen aksonal levhalar oluşumu nedeniyle aksonal phenoype incelemek için geliştirilmiştir9,10. Biz leucine zengin tekrarlı transmembran nöronal 2 (LRRTM2) ile konjugated manyetik boncuk kullanılan uyarıcı presynapses (Şekil 1a)11,12,13ikna etmek için bir presinaptik Organizatör. LRRTM2 boncukları kullanarak, boncuk uygulandığında zaman presynapse oluşumu başlar. Bu presynapse oluşumu aynı zamanda bir nöron topu binlerce akons başlar anlamına gelir, böylece etkili sinaptik proteinler birikiminin kesin zaman ders incelemek için izin verir. Buna ek olarak, nöron top kültürü, hücre gövdelerini kaldırarak Soma ‘dan taşıma sinaptik proteinlerini engellemek için kolaydır (Şekil 1B)8. Biz zaten hücre organları olmadan akons hayatta ve en az 4 saat hücre organları kaldırıldıktan sonra sağlıklı olduğunu doğruladı. Böylece, bu protokol sinaptik proteinlerin (hücre gövdesi veya Akon) türetildiği ve nasıl sinaptik proteinler organize bir şekilde birikir araştırmak için uygundur.
Protocol
Representative Results
Discussion
LRRTM2-boncuk ile nöron topu kültürünü kullanarak uyarılan presynapse oluşumunu incelemek için yeni bir yöntem geliştirdik. Şu anda, presynapse oluşumu tahlil çoğu Poly-D-Lysine içerir (PDL)-kaplamalı boncuk ve Disosiye kültür/microfluidic odası20,21,22. Bu yöntemin avantajlarından biri LRRTM2-Beads. LRRTM2, özellikle11,12,<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, bilimsel araştırmalar için JSPS Grant-ın-Aid (KAKENHI) (C) (No. 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki) tarafından kısmen desteklenmektedir. Biz Dr terukazu Nogi ve Bayan makiko neyazaki (Yokohama City Üniversitesi) nazik biyotinlenmiş LRRTM2 protein sağlamak için teşekkür ederiz. Teknik yardım için Honami Uechi ve Rie Ishii ‘ye de teşekkür ederiz.
Materials
| Antibody diluent | DAKO | S2022 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-585-151 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| mouse anti-Munc18-1 | BD Biosciences | 610336 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Bovine Serum Alubumin (BSA) | Nacalai Tesque | 01863-48 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish) | Nunc | 176740 | |
| Complete EDTA-free | Roche | 11873580001 | |
| cooled CCD camera | Andor Technology | iXON3 | |
| Coverslip | Matsunami | C015001 | Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI) | Nacalai Tesque | 11034-56 | |
| Deoxyribonuclease 1 (DNase I) | Wako pure chemicals | 047-26771 | |
| Expi293 Expression System | Thermo Fisher Scientific | A14635 | |
| Horse serum | Sigma-Aldrich | H1270 | |
| image acquisition software | Nikon | NIS-element AR | |
| Image analysis software | NIH | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Inverted fluorecent microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Neurobasal media | Thermo Fisher Scientific | #21103-049 | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Thermo Fisher Scientific | #143-06561 | |
| N-propyl gallate | Nacalai Tesque | 29303-92 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
Paraplast Plus |
Sigma-Aldrich | P3558 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide (MW > 300,000) | Nacalai Tesque | 28359-54 | |
| poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| Prepacked Disposable PD-10 Columns | GE healthcare | 17085101 | |
| rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1 | Synaptic Systems | 135-302 | |
| SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent) | Nacalai Tesque | 41506-04 | |
| Streptavidin-coated magnetic particles | Spherotech Inc | SVM-40-10 | diameter: 4-5 µm |
| TritonX-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Trypsin | Nacalai Tesque | 18172-94 |
References
- Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).
- Ziv, N. E., Garner, C. C. Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly. Nature Reviews Neuroscience. 5 (5), 385-399 (2004).
- Chia, P. H., Li, P., Shen, K. Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation. Journal of Cell Biology. 203 (1), 11-22 (2013).
- Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
- Saitsu, H., et al. CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia. Epilepsia. 53 (8), 1441-1449 (2012).
- Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. Assembly of New Individual Excitatory Synapses. Neuron. 27 (1), 57-69 (2000).
- Bresler, T., et al. Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (6), 1507-1520 (2004).
- Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis. Neuroscience Research. , (2018).
- Sasaki, Y., et al. Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local β-Actin Synthesis and Growth Cone Turning. Journal of Neuroscience. 30 (28), 9349-9358 (2010).
- Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons. Developmental neurobiology. 74 (3), 397-406 (2014).
- Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
- de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
- Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Hirai, H., et al. Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2. EMBO reports. , (2017).
- Yasui, N., et al. Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 35247-35256 (2011).
- Bassell, G. J., Warren, S. T. Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function. Neuron. 60 (2), 201-214 (2008).
- Darnell, J. C., Klann, E. The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS. Nat Neurosci. 16 (11), 1530-1536 (2013).
- Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome. Nature Reviews Neuroscience. 16 (10), 595-605 (2015).
- Lucido, A. L., et al. Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts. Journal of Neuroscience. 29 (40), 12449-12466 (2009).
- Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal Translation of β-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).
- Batista, A. F. R., Martínez, J. C., Hengst, U. Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals. Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).
