Взаимодействие с и Мембрана Пермябилизация митохондрий мозга амилоида Фибрилс
Summary
Здесь предусмотрен протокол для исследования взаимодействия между родной формой, префибриллярными и зрелыми амилоидными фибриллями различных пептидов и белков с митохондриями, изолированными из различных тканей и различных областей мозга.
Abstract
Растущее количество доказательств указывает на то, что мембранная пермяковая, включая внутренние мембраны, такие как митохондрии, является общей чертой и основным механизмом амилоидной агрегированной токсичности при нейродегенеративных заболеваниях. Однако большинство отчетов, описывающих механизмы нарушения мембран, основаны на фосфолипидных модельных системах, и исследования, непосредственно нацеленные на события, происходящие на уровне биологических мембран, редки. Описана здесь модель для изучения механизмов токсичности амилоидов на мембранном уровне. Для митохондриальной изоляции, градиентная среда плотности используется для получения препаратов с минимальным загрязнением миелина. После подтверждения целостности митохондриальной мембраны, взаимодействие амилоидных фибриллов, возникающих из-за з-синуклеина, бычьего инсулина и куриного яичного белка лизозима (HEWL) с митохондриями мозга крысы, как биологическая модель in vitro, исследуется. Результаты показывают, что лечение митохондрий мозга с фибриллярными сборками может вызвать различные степени проницаемости мембраны и повышения содержания ROS. Это указывает на структурно-зависимые взаимодействия между амилоидными фибрилями и митохондриальной мембраной. Предполагается, что биофизические свойства амилоидных фибрилков и их специфические связывания с митохондриальными мембранами могут служить объяснением некоторых из этих наблюдений.
Introduction
Амилоидные расстройства, известные как амилоидозы, представляют собой большую группу заболеваний, определяемых появлением нерастворимых белковых отложений в различных тканях и органах1,2. Среди них нейродегенеративные расстройства являются наиболее часто встречаются формы, при которых белковые агрегаты появляются в центральной или периферической нервной системе2. Хотя ряд механизмов были предложены, чтобы участвовать в токсичности амилоидных агрегатов3, растущее количество доказательств указывает на нарушение клеточной мембраны и пермяки в качестве основного механизма амилоидной патологии4, 5. В дополнение к плазменной мембране, внутренние органеллы (т.е. митохондрии) также могут быть затронуты.
Интересно, что новые данные свидетельствуют о том, что митохондриальная дисфункция играет важную роль в патогенеза нейродегенеративных расстройств, в том числе болезни Альцгеймера и Паркинсона6,7. В соответствии с этим вопросом, многочисленные доклады указали связывание и накопление амилоида й-пептида, з-синуклеина, Хантингтина и связанных с ALS мутантов SOD1 белков митохондрии8,9,10, 11. Механизм мембранной пермяки амилоидных агрегатов, как полагают, происходит либо через образование дискретных каналов (пор) и/или через неспецифический моющее средство, как механизм5,12, 13. Следует отметить, что большинство из этих выводов были основаны на докладах с использованием фосфолипидных модельных систем, и исследования, непосредственно ориентированные на события, происходящие в биологических мембранах, редки. Очевидно, что эти искусственные липидные двуслойки не обязательно отражают внутренние свойства биологических мембран, в том числе митохондрий, которые являются неоднородными структурами и состоят из широкого спектра фосфолипидов и белков.
В настоящем исследовании, митохондрии, изолированные от мозга крыс используются в качестве биологической модели in vitro для изучения разрушительных эффектов амилоидных фибриллов, возникающих из-синуклеина (как амилоидогенный белок), инсулин абилоидогенных (в качестве модели пептида, показывающего значительные структурные гомологии с человеческим инсулином, участвующих в инъекционно-локализованных амилоидоз), и курица яичный белок лизозим (HEWL; как общий тип белка для изучения амилоидной агрегации). Взаимодействия и возможное повреждение митохондриальных мембран, индуцированных амилоидными фибриллами, затем исследуются, наблюдая за выбросом митохондриального малиата дегидрогеназы (MDH) (расположен в митохондриальной матрице) и митохондрий реактивного кислорода видов (ROS) повышение.
Protocol
Representative Results
Discussion
Богатство экспериментальных результатов подтверждает гипотезу о том, что цитотоксичность фибриллярных агрегатов в значительной степени связана с их способностью взаимодействовать и пронизать биологические мембраны4,5. Однако большая часть данных осн?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Научно-исследовательского совета Института перспективных исследований в области фундаментальных наук (IASBS), Занджан, Иран.
Materials
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate | Sigma | 35845 | |
| Ammonium sulfate | Merck | 1012171000 | |
| Black 96-well plate | Corning | ||
| Black Clear-bottomed 96-well plate | Corning | ||
| Bovine insulin | Sigma | I6634 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| BSA essentially fatty acid-free | Sigma | A6003 | |
| Centrifuge | Sigma | ||
| Crystal clear sealing tape | Corning | ||
| CuSO4 | Sigma | 451657 | |
| Dialysis bag (cut off 2 KDa) | Sigma | D2272 | |
| Dounce homogenizer | Potter Elvehjem | ||
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| Fluorescence plate reader | BioTek | ||
| Fluorescence spectrophotometer | Cary Eclipse VARIAN | ||
| Folin | Merck | F9252 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Guillotine | Made in Iran | ||
| HCl | Merck | H1758 | |
| Hen Egg White Lysozyme (HEWL) | Sigma | L6876 | |
| Na2CO3 | Sigma | S7795 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S7907 | |
| NaOH | Merck | S8045 | |
| Oxaloacetate | Sigma | O4126 | |
| Percoll | GE Healthcare | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | CS0030 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Potassium sodium tartrate | Sigma | 217255 | |
| Quartz cuvette | Sigma | ||
| Spectrophotometer | analytik jena | SPEKOL 2000 model | |
| Succinate | Sigma | S2378 | |
| Sucrose | Merck | 1076871000 | |
| Thermomixer | Eppendorph | ||
| Thioflavin T | Sigma | T3516 | |
| Tris-HCl | Merck | 1082191000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tryptone | QUELAB | ||
| Water bath | Memmert | ||
| Yeast Extract | QUELAB | ||
| β-NADH | Sigma | N8129 |
References
- Merlini, G., Bellotti, V. Molecular mechanisms of amyloidosis. New England Journal of Medicine. 349, 583-596 (2003).
- Berg, I. . Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Linköping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , (2010).
- Kagan, B. L., Uversky, V. N., Fink, A. L. Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage. Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases. , 223-236 (2006).
- Demuro, A., et al. Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers. The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).
- Kayed, R., et al. Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases. The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).
- Manczak, M., Park, B. S., Jung, Y., Reddy, P. H. Differential expression of oxidative phosphorylation genes in patients with Alzheimer’s disease: implications for early mitochondrial dysfunction and oxidative damage. Neuromolecular Medicine. 5, 147-162 (2004).
- Vila, M., Ramonet, D., Perier, C. Mitochondrial alterations in Parkinson’s disease: new clues. Journal of Neurochemistry. 107, 317-328 (2008).
- Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
- Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
- Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington’s disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
- Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
- Kagan, B. L., Azimov, R., Azimova, R. Amyloid peptide channels. The Journal of Membrane Biology. 202, 1-10 (2004).
- Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T., Lansbury, P. T. Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations. Nature. 418, 291 (2002).
- Sims, N. R., Anderson, M. F. Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation. Nature Protocols. 3, 1228-1239 (2008).
- Ghobeh, M., et al. Interaction of Aβ (25-35) Fibrillation Products with Mitochondria: Effect of Small-Molecule Natural Products. Peptide Science. 102, 473-486 (2014).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the folin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry. 193, 265-275 (1951).
- Sottocasa, G. L., Kuylenstierna, B., Ernester, L., Bergstrand, A. Separation and some enzymatic properties of the inner and outer membrane of rat liver mitochondria. Methods in Enzymology. 10, 448-463 (1967).
- Hoyer, W., et al. Dependence of a-Synuclein Aggregate Morphology on Solution Conditions. Journal of Molecular Biology. 322, 383-393 (2002).
- Weinreb, P. H., et al. NACP, a protein implicated in Alzheimer’s disease and learning, is natively unfolded. Biochemistry. 35, 13709-13715 (1996).
- Porter, R. R. Partition chromatography of insulin and other proteins. The Biochemical Journal. 53, 320-328 (1953).
- Goldberg, M. E., Rudolph, R., Jaenicke, R. A kinetic study of the competition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured reduced egg white lysozyme. Biochemistry. 30, 2790-2797 (1991).
- Young, T. A., Cunningham, C. C., Bailey, S. M. Reactive oxygen species production by the mitochondrial respiratory chain in isolated rat hepatocytes and liver mitochondria: studies using myxothiazol. Archives of Biochemistry and Biophysics. 405, 65-72 (2002).
- Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Membrane integrity and amyloid cytotoxicity: a model study involving mitochondria and lysozyme fibrillation products. Journal of Molecular Biology. 409, 826-838 (2011).
- Katebi, B., Mahdavimehr, M., Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Protective effects of silibinin on insulin amyloid fibrillation, cytotoxicity and mitochondrial membrane damage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 659, 22-32 (2018).
- Fink, A. L. The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein. Accounts of Chemical Research. 39, 628-634 (2006).
- Diraviyam, K., Stahelin, R. V., Cho, W., Murray, D. Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains. Journal of Molecular Biology. 328, 721-736 (2003).
- Van Rooijen, B. D., Claessens, M., Subramaniam, V. Lipid bilayer disruption by oligomeric α-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core. Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).
- Kourie, J. I., Henry, C. L. Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 29, 741-753 (2002).
- Bucciantini, M., et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature. 416, 507-511 (2002).
- Bolognesi, B., et al. ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species. ACS Chemical Biology. 5, 735-740 (2010).
- Posse, E., De Arcuri, B. F., Morero, R. D. Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content. Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).
- Roqanian, S., et al. Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action. International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).
- Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein. The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).
- Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains. Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).
- Devi, L., et al. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
- Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. Interaction of α-synuclein with biomembranes in Parkinson’s disease-role of cardiolipin. Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).
- Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
- Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington’s disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
- Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
- Oladzad Abbasabadi, A., et al. Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1. International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).
