Interactions avec et perméabilisation des membranes des mitochondries cérébrales par amyloïde Fibrils
Summary
Fourni ici est un protocole pour étudier les interactions entre la forme indigène, préfibrillaire, et les fibrilles amyloïdes matures de différents peptides et protéines avec des mitochondries isolées de différents tissus et diverses zones du cerveau.
Abstract
Un corps croissant de preuves indique que la perméabilisation de membrane, y compris les membranes internes telles que des mitochondries, est une caractéristique commune et le mécanisme primaire de la toxicité amyloïde d’agrégat-induite dans les maladies neurodegenerative. Cependant, la plupart des rapports décrivant les mécanismes de la perturbation de membrane sont basés sur des systèmes de modèle de phospholipid, et les études ciblant directement des événements se produisant au niveau des membranes biologiques sont rares. Décrit ici est un modèle pour étudier les mécanismes de la toxicité amyloïde au niveau de la membrane. Pour l’isolement mitochondrial, le milieu de gradient de densité est utilisé pour obtenir des préparations avec une contamination minimale de la myéline. Après confirmation d’intégrité de membrane mitochondriale, l’interaction des fibrilles amyloïdes résultant de la synuclein, de l’insuline bovine, et du lysozyme blanc d’oeuf de poule (HEWL) avec des mitochondries de cerveau de rat, comme modèle biologique in vitro, est étudiée. Les résultats démontrent que le traitement des mitochondries cérébrales avec des assemblages fibrillaires peut causer différents degrés de perméabilisation de la membrane et l’amélioration de la teneur en ROS. Ceci indique des interactions structure-dépendantes entre les fibrilles amyloïdes et la membrane mitochondriale. On lui suggère que les propriétés biophysiques des fibrilles amyloïdes et leur liaison spécifique aux membranes mitochondriales puissent fournir des explications pour certaines de ces observations.
Introduction
Les troubles amyloïdes, connus sous le nom d’amyloïdes, constituent un grand groupe de maladies définies par l’apparition de dépôts insolubles de protéines dans différents tissus et organes1,2. Parmi eux, les troubles neurodégénératifs sont les formes les plus fréquentes dans lesquelles les agrégats protéiques apparaissent dans le système nerveux central ou périphérique2. Bien qu’un certain nombre de mécanismes aient été proposés pour être impliqués dans la toxicité des agrégats amyloïdes3, un corps croissant de preuves indique la perturbation et la perméabilisation de membrane cellulaire comme mécanisme primaire de la pathologie amyloïde4, 5. En plus de la membrane plasmatique, les organites internes (c.-à-d. les mitochondries) peuvent également être affectés.
Fait intéressant, les preuves émergentes suggèrent que le dysfonctionnement mitochondrial joue un rôle critique dans la pathogénie des désordres neurodegenerative, y compris la maladie d’Alzheimer et la maladie de Parkinson6,7. Conformément à ce numéro, de nombreux rapports ont indiqué la liaison et l’accumulation de l’amyloïde- peptide, de la synucléine, de la huntingtine et des protéines SOD1 mutantes liées à la SLA aux mitochondries8,9,10, 11. On pense que le mécanisme de perméabilisation de la membrane par les agrégats amyloïdes se produit soit par la formation de canaux discrets (pores) et/ou par un mécanisme non spécifique de détergent-like5,12, 13. Il est à noter que la plupart de ces conclusions ont été basées sur des rapports impliquant des systèmes modèles phospholipides, et les études ciblant directement les événements se produisant dans les membranes biologiques sont rares. De toute évidence, ces bicouches lipidiques artificielles ne reflètent pas nécessairement les propriétés intrinsèques des membranes biologiques, y compris celles des mitochondries, qui sont des structures hétérogènes et composées d’une grande variété de phospholipides et de protéines.
Dans la présente étude, les mitochondries isolées du cerveau des rats sont utilisées comme modèle biologique in vitro pour examiner les effets destructeurs des fibrilles amyloïdes résultant de la synucléine (en tant que protéine amyloïdogénique), de l’insuline bovine (comme modèle de peptide montrant homologie structurale significative avec l’insuline humaine impliquée dans l’amyloidosis injection-localisée), et lysozyme blanc d’oeuf de poule (HEWL ; comme protéine modèle commune pour l’étude de l’agrégation amyloïde). Les interactions et les dommages possibles des membranes mitochondriales induites par les fibrilles amyloïdes sont alors étudiés en observant la libération de la déshydrogénase mitochondriale (MDH) (située dans la matrice mitochondriale) et de l’oxygène réactif des mitochondries l’amélioration des espèces (ROS).
Protocol
Representative Results
Discussion
Une multitude de résultats expérimentaux appuie l’hypothèse que la cytotoxicité des agrégats fibrillaires est significativement associée à leur capacité d’interagir avec les membranes biologiques et de perméabilize4,5. Cependant, la plupart des données sont basées sur des bicouches lipidiques artificielles qui ne reflètent pas nécessairement les propriétés intrinsèques des membranes biologiques, qui sont des structures hétérogènes avec une gran…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par des subventions du Conseil de recherche de l’Institute for Advanced Studies in Basic Sciences (IASBS), À Zanjan, en Iran.
Materials
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate | Sigma | 35845 | |
| Ammonium sulfate | Merck | 1012171000 | |
| Black 96-well plate | Corning | ||
| Black Clear-bottomed 96-well plate | Corning | ||
| Bovine insulin | Sigma | I6634 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| BSA essentially fatty acid-free | Sigma | A6003 | |
| Centrifuge | Sigma | ||
| Crystal clear sealing tape | Corning | ||
| CuSO4 | Sigma | 451657 | |
| Dialysis bag (cut off 2 KDa) | Sigma | D2272 | |
| Dounce homogenizer | Potter Elvehjem | ||
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| Fluorescence plate reader | BioTek | ||
| Fluorescence spectrophotometer | Cary Eclipse VARIAN | ||
| Folin | Merck | F9252 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Guillotine | Made in Iran | ||
| HCl | Merck | H1758 | |
| Hen Egg White Lysozyme (HEWL) | Sigma | L6876 | |
| Na2CO3 | Sigma | S7795 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S7907 | |
| NaOH | Merck | S8045 | |
| Oxaloacetate | Sigma | O4126 | |
| Percoll | GE Healthcare | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | CS0030 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Potassium sodium tartrate | Sigma | 217255 | |
| Quartz cuvette | Sigma | ||
| Spectrophotometer | analytik jena | SPEKOL 2000 model | |
| Succinate | Sigma | S2378 | |
| Sucrose | Merck | 1076871000 | |
| Thermomixer | Eppendorph | ||
| Thioflavin T | Sigma | T3516 | |
| Tris-HCl | Merck | 1082191000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tryptone | QUELAB | ||
| Water bath | Memmert | ||
| Yeast Extract | QUELAB | ||
| β-NADH | Sigma | N8129 |
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