Interacciones con y la permeabilización de membrana de las mitocondrias cerebrales por Amiloide Fibrils
Summary
Aquí se proporciona un protocolo para investigar las interacciones entre la forma nativa, las fibrillas prefibrilares y las fibrillas amiloideas maduras de diferentes péptidos y proteínas con mitocondrias aisladas de diferentes tejidos y diversas áreas del cerebro.
Abstract
Un creciente cuerpo de evidencia indica que la permeabilización de la membrana, incluyendo membranas internas como las mitocondrias, es una característica común y el mecanismo primario de toxicidad inducida por agregadoa amiloide en enfermedades neurodegenerativas. Sin embargo, la mayoría de los informes que describen los mecanismos de interrupción de la membrana se basan en sistemas de modelos de fosfolípidos, y los estudios dirigidos directamente a los eventos que ocurren a nivel de membranas biológicas son raros. Descrito aquí es un modelo para estudiar los mecanismos de toxicidad amiloide a nivel de membrana. Para el aislamiento mitocondrial, el medio de gradiente de densidad se utiliza para obtener preparaciones con una contaminación mínima de la mielina. Después de la confirmación de la integridad de la integridad de la membrana mitocondrial, se investiga la interacción de las fibrillas amiloide derivadas de la sinucleína, la insulina bovina y el lysozima blanca de huevo de hien (HEWL) con las mitocondrias cerebrales de rata, como modelo biológico in vitro. Los resultados demuestran que el tratamiento de las mitocondrias cerebrales con conjuntos fibrilares puede causar diferentes grados de permeabilización de la membrana y mejora del contenido de ROS. Esto indica interacciones dependientes de la estructura entre las fibrillas amiloideas y la membrana mitocondrial. Se sugiere que las propiedades biofísicas de las fibrillas amiloideas y su unión específica a las membranas mitocondriales pueden proporcionar explicaciones para algunas de estas observaciones.
Introduction
Los trastornos relacionados con el amiloide, conocidos como amiloidosis, constituyen un gran grupo de enfermedades definidas por la aparición de depósitos de proteínas insolubles en diferentes tejidos y órganos1,2. Entre ellos, los trastornos neurodegenerativos son las formas más frecuentes en las que aparecen agregados proteicos en el sistema nervioso central o periférico2. Aunque se ha propuesto que una serie de mecanismos participen en la toxicidad de los agregados amiloide3 , un creciente cuerpo de evidencia apunta a la alteración de la membrana celular y la permeabilización como el mecanismo primario de la patología amiloide4, 5. Además de la membrana plasmática, los orgánulos internos (es decir, las mitocondrias) también pueden verse afectados.
Curiosamente, la evidencia emergente sugiere que la disfunción mitocondrial juega un papel crítico en la patogénesis de los trastornos neurodegenerativos, incluyendo la enfermedad de Alzheimer y Parkinson6,7. De acuerdo con este número, numerosos informes han indicado la unión y acumulación de amiloides-péptido, sinucleína, Huntingtin, y proteínas MUTANTes SOD1 vinculadas a ELA a las mitocondrias8,9,10, 11. Se cree que el mecanismo de permeabilización de la membrana por agregados amiloide ocurre ya sea a través de la formación de canales discretos (poros) y/o a través de un mecanismo no específico similar al detergente5,12, 13. Cabe destacar que la mayoría de estas conclusiones se han basado en informes que involucran sistemas de modelos de fosfolípidos, y los estudios dirigidos directamente a los eventos que ocurren en las membranas biológicas son raros. Claramente, estas bicapas de lípidos artificiales no reflejan necesariamente las propiedades intrínsecas de las membranas biológicas, incluidas las de las mitocondrias, que son estructuras heterogéneas y están compuestas por una amplia variedad de fosfolípidos y proteínas.
En el presente estudio, las mitocondrias aisladas de cerebros de ratas se utilizan como modelo biológico in vitro para examinar los efectos destructivos de las fibrillas amiloideas derivadas de la sinucleína (como proteína amiloidógena), insulina bovina (como un péptido modelo que muestra homología estructural significativa con insulina humana implicada en la amiloidosis localizada por inyección), y lisozima blanca de huevo de gallina (HEWL; como una proteína modelo común para el estudio de la agregación amiloide). Las interacciones y posibles daños de las membranas mitocondriales inducidas por las fibrillas amiloides se investigan observando la liberación de malato mitocondrial deshidrogenasa (MDH) (ubicado en la matriz mitocondrial) y oxígeno reactivo mitocondria (ROS).
Protocol
Representative Results
Discussion
Una gran cantidad de resultados experimentales apoya la hipótesis de que la citotoxicidad de los agregados fibrilares se asocia significativamente con su capacidad para interactuar y permeabilizar las membranas biológicas4,5. Sin embargo, la mayoría de los datos se basan en bicapas de lípidos artificiales que no reflejan necesariamente las propiedades intrínsecas de las membranas biológicas, que son estructuras heterogéneas con una amplia variedad de fosfo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Consejo de Investigación del Instituto de Estudios Avanzados en Ciencias Básicas (IASBS), Zanjan, Irán.
Materials
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate | Sigma | 35845 | |
| Ammonium sulfate | Merck | 1012171000 | |
| Black 96-well plate | Corning | ||
| Black Clear-bottomed 96-well plate | Corning | ||
| Bovine insulin | Sigma | I6634 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| BSA essentially fatty acid-free | Sigma | A6003 | |
| Centrifuge | Sigma | ||
| Crystal clear sealing tape | Corning | ||
| CuSO4 | Sigma | 451657 | |
| Dialysis bag (cut off 2 KDa) | Sigma | D2272 | |
| Dounce homogenizer | Potter Elvehjem | ||
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| Fluorescence plate reader | BioTek | ||
| Fluorescence spectrophotometer | Cary Eclipse VARIAN | ||
| Folin | Merck | F9252 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Guillotine | Made in Iran | ||
| HCl | Merck | H1758 | |
| Hen Egg White Lysozyme (HEWL) | Sigma | L6876 | |
| Na2CO3 | Sigma | S7795 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S7907 | |
| NaOH | Merck | S8045 | |
| Oxaloacetate | Sigma | O4126 | |
| Percoll | GE Healthcare | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | CS0030 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Potassium sodium tartrate | Sigma | 217255 | |
| Quartz cuvette | Sigma | ||
| Spectrophotometer | analytik jena | SPEKOL 2000 model | |
| Succinate | Sigma | S2378 | |
| Sucrose | Merck | 1076871000 | |
| Thermomixer | Eppendorph | ||
| Thioflavin T | Sigma | T3516 | |
| Tris-HCl | Merck | 1082191000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tryptone | QUELAB | ||
| Water bath | Memmert | ||
| Yeast Extract | QUELAB | ||
| β-NADH | Sigma | N8129 |
References
- Merlini, G., Bellotti, V. Molecular mechanisms of amyloidosis. New England Journal of Medicine. 349, 583-596 (2003).
- Berg, I. . Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Linköping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , (2010).
- Kagan, B. L., Uversky, V. N., Fink, A. L. Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage. Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases. , 223-236 (2006).
- Demuro, A., et al. Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers. The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).
- Kayed, R., et al. Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases. The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).
- Manczak, M., Park, B. S., Jung, Y., Reddy, P. H. Differential expression of oxidative phosphorylation genes in patients with Alzheimer’s disease: implications for early mitochondrial dysfunction and oxidative damage. Neuromolecular Medicine. 5, 147-162 (2004).
- Vila, M., Ramonet, D., Perier, C. Mitochondrial alterations in Parkinson’s disease: new clues. Journal of Neurochemistry. 107, 317-328 (2008).
- Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
- Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
- Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington’s disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
- Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
- Kagan, B. L., Azimov, R., Azimova, R. Amyloid peptide channels. The Journal of Membrane Biology. 202, 1-10 (2004).
- Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T., Lansbury, P. T. Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations. Nature. 418, 291 (2002).
- Sims, N. R., Anderson, M. F. Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation. Nature Protocols. 3, 1228-1239 (2008).
- Ghobeh, M., et al. Interaction of Aβ (25-35) Fibrillation Products with Mitochondria: Effect of Small-Molecule Natural Products. Peptide Science. 102, 473-486 (2014).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the folin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry. 193, 265-275 (1951).
- Sottocasa, G. L., Kuylenstierna, B., Ernester, L., Bergstrand, A. Separation and some enzymatic properties of the inner and outer membrane of rat liver mitochondria. Methods in Enzymology. 10, 448-463 (1967).
- Hoyer, W., et al. Dependence of a-Synuclein Aggregate Morphology on Solution Conditions. Journal of Molecular Biology. 322, 383-393 (2002).
- Weinreb, P. H., et al. NACP, a protein implicated in Alzheimer’s disease and learning, is natively unfolded. Biochemistry. 35, 13709-13715 (1996).
- Porter, R. R. Partition chromatography of insulin and other proteins. The Biochemical Journal. 53, 320-328 (1953).
- Goldberg, M. E., Rudolph, R., Jaenicke, R. A kinetic study of the competition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured reduced egg white lysozyme. Biochemistry. 30, 2790-2797 (1991).
- Young, T. A., Cunningham, C. C., Bailey, S. M. Reactive oxygen species production by the mitochondrial respiratory chain in isolated rat hepatocytes and liver mitochondria: studies using myxothiazol. Archives of Biochemistry and Biophysics. 405, 65-72 (2002).
- Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Membrane integrity and amyloid cytotoxicity: a model study involving mitochondria and lysozyme fibrillation products. Journal of Molecular Biology. 409, 826-838 (2011).
- Katebi, B., Mahdavimehr, M., Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Protective effects of silibinin on insulin amyloid fibrillation, cytotoxicity and mitochondrial membrane damage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 659, 22-32 (2018).
- Fink, A. L. The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein. Accounts of Chemical Research. 39, 628-634 (2006).
- Diraviyam, K., Stahelin, R. V., Cho, W., Murray, D. Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains. Journal of Molecular Biology. 328, 721-736 (2003).
- Van Rooijen, B. D., Claessens, M., Subramaniam, V. Lipid bilayer disruption by oligomeric α-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core. Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).
- Kourie, J. I., Henry, C. L. Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 29, 741-753 (2002).
- Bucciantini, M., et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature. 416, 507-511 (2002).
- Bolognesi, B., et al. ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species. ACS Chemical Biology. 5, 735-740 (2010).
- Posse, E., De Arcuri, B. F., Morero, R. D. Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content. Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).
- Roqanian, S., et al. Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action. International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).
- Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein. The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).
- Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains. Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).
- Devi, L., et al. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
- Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. Interaction of α-synuclein with biomembranes in Parkinson’s disease-role of cardiolipin. Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).
- Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
- Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington’s disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
- Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
- Oladzad Abbasabadi, A., et al. Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1. International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).
