Wechselwirkungen mit und Membranpermeabilisierung des Gehirns Mitochondrien durch Amyloid Fibrils
Summary
Hier ist ein Protokoll zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen nativer Form, Präfibrillar und reifen Amyloidfibrillen verschiedener Peptide und Proteine mit Mitochondrien aus verschiedenen Geweben und verschiedenen Bereichen des Gehirns isoliert.
Abstract
Eine wachsende Zahl von Beweisen zeigt, dass Membranpermeabilisierung, einschließlich der inneren Membranen wie Mitochondrien, ist ein gemeinsames Merkmal und primärer Mechanismus der Amyloid-Aggregat-induzierte Toxizität bei neurodegenerativen Erkrankungen. Die meisten Berichte, die die Mechanismen der Membranstörung beschreiben, basieren jedoch auf Phospholipid-Modellsystemen, und Studien, die direkt auf Ereignisse abzielen, die auf der Ebene biologischer Membranen auftreten, sind selten. Beschrieben hier ist ein Modell für die Untersuchung der Mechanismen der Amyloid-Toxizität auf Membranebene. Für die mitochondriale Isolierung wird ein Dichtegradientenmedium verwendet, um Präparate mit minimaler Myelinkontamination zu erhalten. Nach der Bestätigung der mitochondrialen Membranintegrität wird die Wechselwirkung von Amyloidfibrillen, die aus dem In-vitro-Biologischen Modell von Synuclein, Rinderinsulin und Hühnereiweißlysozym (HEWL) mit Rattenhirn-Mitochondrien als in vitro biologisches Modell entstehen, untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung von Hirnmitochondrien mit fibrillaren Baugruppen unterschiedliche Grade der Membranpermeabilisation und ROS-Gehaltsverbesserung verursachen kann. Dies deutet auf strukturabhängige Wechselwirkungen zwischen Amyloidfibrillen und mitochondrialer Membran hin. Es wird vermutet, dass biophysikalische Eigenschaften von Amyloidfibrillen und deren spezifische Bindung an mitochondriale Membranen Erklärungen für einige dieser Beobachtungen liefern können.
Introduction
Amyloid-bedingte Störungen, bekannt als Amyloidosen, stellen eine große Gruppe von Krankheiten dar, die durch das Auftreten unlöslicher Proteinablagerungen in verschiedenen Geweben und Organen definiert sind1,2. Unter ihnen sind neurodegenerative Erkrankungen die häufigsten Formen, in denen Proteinaggregate im zentralen oder peripheren Nervensystem auftreten2. Obwohl eine Reihe von Mechanismen vorgeschlagen wurden, um in die Toxizität von Amyloid-Aggregaten beteiligt werden3, eine wachsende Menge von Beweisen deutet auf Zellmembran-Störung und Permeabilisierung als primärer Mechanismus der Amyloidpathologie4, 5. Neben der Plasmamembran können auch innere Organellen (d.h. Mitochondrien) betroffen sein.
Interessanterweise deuten neue Erkenntnisse darauf hin, dass mitochondriale Dysfunktion eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese neurodegenerativer Erkrankungen spielt, einschließlich Alzheimer und ParkinsonErkrankungen 6,7. In Übereinstimmung mit dieser Ausgabe haben zahlreiche Berichte auf eine Bindung und Akkumulation von Amyloid-Peptid, -synuclein, Huntingtin und ALS-verknüpften mutierten SOD1-Proteinen an Mitochondrien8,9,10 11. Der Mechanismus der Membranpermeabilisierung durch Amyloidaggregate wird entweder durch Bildung diskreter Kanäle (Poren) und/oder durch einen unspezifischen Waschmittel-ähnlichen Mechanismus5,12, 13. Bemerkenswert ist, dass die meisten dieser Schlussfolgerungen auf Berichten mit Phospholipid-Modellsystemen basieren, und Studien, die direkt auf die Ereignisse in biologischen Membranen abzielen, sind selten. Es ist klar, dass diese künstlichen Lipid-Doppelschichten nicht unbedingt die intrinsischen Eigenschaften biologischer Membranen widerspiegeln, einschließlich der mitochondrien, die heterogene Strukturen sind und aus einer Vielzahl von Phospholipiden und Proteinen bestehen.
In der vorliegenden Studie werden Von Rattenhirnen isolierte Mitochondrien als in vitro biologisches Modell verwendet, um die zerstörerischen Wirkungen von Amyloidfibrillen zu untersuchen, die aus dem signifikante strukturelle Homologie mit humanem Insulin, das an einer injektionslokalisierten Amyloidose beteiligt ist), und Hühnereiweißlysozym (HEWL; als gemeinsames Modellprotein zur Untersuchung der Amyloid-Aggregation). Die Wechselwirkungen und möglichen Schäden von mitochondrialen Membranen, die durch Amyloidfibrillen induziert werden, werden dann untersucht, indem die Freisetzung von mitochondrialer Malatdehydrogenase (MDH) (in der mitochondrialen Matrix) und mitochondrienem reaktiven Sauerstoff beobachtet wird. Arten (ROS) Verbesserung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine Fülle von experimentellen Ergebnissen stützt die Hypothese, dass die Zytotoxizität von fibrillaren Aggregaten signifikant mit ihrer Fähigkeit verbunden ist, mit biologischen Membranen zu interagieren und sie zu durchdringen4,5. Die meisten Daten basieren jedoch auf künstlichen Lipid-Doppelschichten, die nicht unbedingt die intrinsischen Eigenschaften biologischer Membranen widerspiegeln, die heterogene Strukturen mit einer Vielzahl von Phospholipiden un…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Stipendien des Research Council des Institute for Advanced Studies in Basic Sciences (IASBS), Zanjan, Iran, unterstützt.
Materials
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate | Sigma | 35845 | |
| Ammonium sulfate | Merck | 1012171000 | |
| Black 96-well plate | Corning | ||
| Black Clear-bottomed 96-well plate | Corning | ||
| Bovine insulin | Sigma | I6634 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| BSA essentially fatty acid-free | Sigma | A6003 | |
| Centrifuge | Sigma | ||
| Crystal clear sealing tape | Corning | ||
| CuSO4 | Sigma | 451657 | |
| Dialysis bag (cut off 2 KDa) | Sigma | D2272 | |
| Dounce homogenizer | Potter Elvehjem | ||
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| Fluorescence plate reader | BioTek | ||
| Fluorescence spectrophotometer | Cary Eclipse VARIAN | ||
| Folin | Merck | F9252 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Guillotine | Made in Iran | ||
| HCl | Merck | H1758 | |
| Hen Egg White Lysozyme (HEWL) | Sigma | L6876 | |
| Na2CO3 | Sigma | S7795 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S7907 | |
| NaOH | Merck | S8045 | |
| Oxaloacetate | Sigma | O4126 | |
| Percoll | GE Healthcare | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | CS0030 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Potassium sodium tartrate | Sigma | 217255 | |
| Quartz cuvette | Sigma | ||
| Spectrophotometer | analytik jena | SPEKOL 2000 model | |
| Succinate | Sigma | S2378 | |
| Sucrose | Merck | 1076871000 | |
| Thermomixer | Eppendorph | ||
| Thioflavin T | Sigma | T3516 | |
| Tris-HCl | Merck | 1082191000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tryptone | QUELAB | ||
| Water bath | Memmert | ||
| Yeast Extract | QUELAB | ||
| β-NADH | Sigma | N8129 |
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