Summary

Murine Ince bağırsak INTRAEPİTELYAL lenfosit intravital görüntüleme

Published: June 24, 2019
doi:

Summary

Biz GFP etiketli γδ IELS görselleştirmek için bir yöntem açıklamak, ters dönen disk konfoksel mikroskobu tarafından murine ince bağırsak intravital görüntüleme kullanarak. Bu teknik, 4 h ‘ye kadar mukoza içindeki canlı hücrelerin takibini sağlar ve çeşitli bağırsak immün-epitelyal etkileşimleri araştırmak için kullanılabilir.

Abstract

İntraepitelyal lenfositler γδ T hücre reseptörü (γδ ITO) intestinal epitelin bağışıklık gözetiminde önemli bir rol oynamaktadır. Γδ T hücre reseptörü için kesin bir ligand eksikliği kısmen nedeniyle, γδ IEL aktivasyonu ve fonksiyonları in vivo düzenlenmesi bizim anlayış sınırlı kalır. Bu, γδ IEL fonksiyonunun düzenlenmesi ve bu hücrelerin yerel mikroortama yanıt vermesiyle ilgili sinyalizasyon yollarını sorgulamak için Alternatif stratejilerin gelişmesini gerektirir. Γδ IELS, patojen translocation sınırlamak için yaygın olarak anlaşılabilse de, intravital görüntüleme kullanımı istikrarlı devlet ve invaziv patojenlere yanıt olarak IEL/epitelyal etkileşimlerin uzayotemporal dinamiklerini anlamak için kritik öneme sahiptir. Bu belgede, ters dönen disk konfoksal lazer mikroskobu kullanarak bir GFP γδ T hücreli muhabir Mouse ‘un küçük bağırsak mukozasında IEL göç davranışlarını görselleştirmede bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşımın maksimum görüntüleme derinliği iki foton lazer tarama mikroskopinin kullanımına göre sınırlı olsa da, Spinning disk konfoderi lazer mikroskobu, yüksek hızda görüntü edinimi ile azaltılmış fotokleaching ve fotohasar. 4D görüntü analiz yazılımını kullanarak, T hücresi gözetim davranışı ve komşu hücrelerle etkileşimleri, bağırsak mukozası içinde IEL aktivasyonu ve fonksiyonu konusunda ek bilgi sağlamak için deneysel manipülasyon aşağıdaki analiz edilebilir.

Introduction

İntraepitelyal lenfositler (IEL) intestinal epitelin içinde yer alır ve hem Bodrum membranı boyunca hem de lateral hücre içi uzayda bitişik epitelyal hücreler arasında bulunur1. Her 5-10 epitelyal hücreler için yaklaşık bir IEL vardır; Bu iels, intestinal epitelyal bariyer2‘ nin büyük genişinde bağışıklık gözetimi sağlamak için nöbetçiler olarak hizmet vermektedir. Γδ T hücre reseptörü (TCR) ifade eden IELs, murine ince bağırsaktaki toplam IEL nüfusunun% 60 ‘ una kadar oluşur. Γδ T-Cell-eksikliği fareler içinde çalışmalar intestinal yaralanma, inflamasyon ve enfeksiyon yanıt olarak bu hücrelerin büyük ölçüde koruyucu rol göstermek3,4,5. Tcrd nakavt fare6neslini rağmen γδ IEL biyolojisinin anlayışımız, γδ TCR tarafından tanınan ligin henüz7tanımlanmasına bağlı olarak sınırlı kalır. Sonuç olarak, bu hücre nüfusunu incelemek için araçların olmaması, fiziksel ve patolojik koşullarda γδ TCR aktivasyonu ve fonksiyonunun rolünü araştırmayı zorlaştırdı. Bu boşluğu doldurmak için γδ IEL göç davranışlarını ve komşu enteranositlerle olan etkileşimleri, γδ IEL fonksiyonu ve dış uyaranlara yanıt verme konusunda ek bilgi sağlamak için bir araç olarak görselleştiren canlı görüntüleme teknikleri geliştirdik.

Son on yıl içinde, intravital görüntüleme önemli ölçüde bağırsak biyolojisinin çoklu yönleriyle ilgili moleküler olayların anlayışımızı genişletti, epitelyal hücre dökülme dahil olmak üzere8, epitelyal bariyer fonksiyonunun düzenlenmesi9 ,10, luminal içeriğin miyeloid hücre örnekleme11,12, ve ev sahibi-mikrobe etkileşimleri11,13,14,15,16 . İel biyolojisi bağlamında, intravital mikroskopi kullanımı, iel motilitesi ‘nin yer alan dinamiklerine ve gözetim davranışlarına arabuluculuk edici faktörlere ışık tutmıştır13,14,15, 16 yaşında. TcrdH2BeGFP (tcrdegfp) muhabiri fareler, hangi Etiketler γδ iels nükleer Gfp ifade tarafından17, ortaya γδ iels son derece epitelyum içinde hareketli ve sergiler mikrobiyal duyarlı benzersiz bir gözetim davranışı enfeksiyon17,13,14. Son zamanlarda, başka bir γδ T hücre muhabiri fare geliştirilen (Tcrd-GDL) hangi sitoplazmada Gfp ifade tüm hücrenin görselleştirme izin18. Benzer metodoloji, özel kemokin reseptörlerinin gerekliliğini araştırmak için kullanılmıştır, örneğin G protein-bağlantılı reseptör (GPCR)-18 ve-55, IEL motilitesi19,20dinamikleri üzerinde. Hücreye özgü bir muhabir yokluğunda, CD8α karşı Floresan konjuite antikorları görselleştirmek ve iz hareket için kullanıldı19,20. Iki-foton lazer tarama mikroskobu yaygın intravital görüntüleme için kullanılan rağmen, Spinning disk konfeti lazer mikroskopinin kullanımı minimal arka plan gürültüsü ile yüksek hız ve yüksek çözünürlüklü çok kanallı görüntüleri yakalamak için benzersiz avantajlar sağlar. Bu teknoloji, bağırsak mukozasının kompleks mikroortamında bağışıklık/epitelyal etkileşimlerin uzamsal dinamiklerini hafifletmek için idealdir. Dahası, çeşitli transjenik ve/veya nakavt fare modellerinin kullanımı sayesinde, bu çalışmalar bağırsak immün ve/veya epitelyal hücre fonksiyonunun moleküler düzenlemesine ilişkin bilgi sağlayabilir.

Protocol

Rutgers New Jersey Tıp Fakültesi Karşılaştırmalı Tıp kaynakları tarafından onaylanan protokollere göre, tüm çalışmalar laboratuar hayvan bakımı (AALAC) değerlendirme ve Akreditasyon Birliği ‘nde yapılmıştır. 1. fare hazırlama Not: Aşağıdaki prosedür, hayvan hazırlığı ve cerrahisi de dahil olmak üzere, 30 – 40 dakika sürer. ameliyattan önce, mikroskobu açın ve 37 °C ‘ ye mikroskop üzerinde kapalı kuluçta ısı…

Representative Results

TcrdEGFP muhabiri fareler intravital görüntüleme kullanarak, daha önce bu γδ IELs bir dinamik gözetim davranışı, hangi onlar Bodrum membranı boyunca göç ve lateral hücre içi boşluk (LIS) içine sabit olarak epitelyum devriye sergiler göstermiştir (Şekil 2, Film 1). Bu yaklaşım, belirli hücre sinyalizasyon yollarının ve/veya reseptörlerin inhibisyonu γδ IOL göç davranışını nasıl etkilediğini değerlendirmek için …

Discussion

İntravital mikroskopi tekniklerinin geliştirilmesi, hücre içi yapıların8,9,22, hücreli hücre etkileşimleri12‘ nin yeniden yapılanma izlemek için görülmemiş bir fırsat sağladı 25 ve hücre göç davranışı13,14,15,16,</s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma NıH R21 AI143892, New Jersey Sağlık Vakfı Grant, Busch Biyomedikal Grant (KLE) tarafından desteklenmektedir. Madeleine hu ‘ya, el yazması düzenlemede yaptığı yardım ve temsili sonuçlarında gösterilen verileri sağlamak için teşekkür ederiz.

Materials

35mm dish, No. 1.5 Coverslip MatTek P35G-1.5-14-C
Alexa Fluor 633 Hydrazide Invitrogen A30634
BD PrecisionGlide Hypodermic needles – 27g Thermo Fisher Scientific 14-826-48
BD Slip Tip Sterile Syringe – 1 ml Thermo Fisher Scientific 14-823-434
BD Tuberculin Syringe Thermo Fisher Scientific 14-829-9
Dissecting scissors Thermo Fisher Scientific 08-940
Electrocautery Thermo Fisher Scientific 50822501
Enclosed incubation chamber OKOLAB Microscope
Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length Roboz RS-7983-3
Hank's Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich 55037C
Hoechst 33342 Invitrogen H3570
Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules Bitplane Software
Inverted DMi8 Leica Microscope
IQ3 (v. 3.6.3) Andor Software
Ketamine Putney Anesthesia
Kimwipes VWR 21905-026
McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5X0.15mm Straight Sharp Roboz RS-5600
Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided Fisher Scientific NC0798934
Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2mm Tip Roboz RS-5228
Puralube Vet Ointment Dechra Lubricating Eye Ointment
Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser Andor Confocal system
Xylazine Akorn Anesthesia

References

  1. Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 11 (7), 445-456 (2011).
  2. Hu, M. D., Edelblum, K. L. Sentinels at the frontline: the role of intraepithelial lymphocytes in inflammatory bowel disease. Current Pharmacology Reports. 3 (6), 321-334 (2017).
  3. Chen, Y., Chou, K., Fuchs, E., Havran, W. L., Boismenu, R. Protection of the intestinal mucosa by intraepithelial gamma delta T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (22), 14338-14343 (2002).
  4. Swamy, M., et al. Intestinal intraepithelial lymphocyte activation promotes innate antiviral resistance. Nature Communications. 6, 7090 (2015).
  5. Dalton, J. E., et al. Intraepithelial gammadelta+ lymphocytes maintain the integrity of intestinal epithelial tight junctions in response to infection. Gastroenterology. 131 (3), 818-829 (2006).
  6. Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75 (2), 274-282 (1993).
  7. Willcox, B. E., Willcox, C. R. gammadelta TCR ligands: the quest to solve a 500-million-year-old mystery. Nature Immunology. 20 (2), 121-128 (2019).
  8. Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), e1201-e1202 (2011).
  9. Marchiando, A. M., et al. Caveolin-1-dependent occludin endocytosis is required for TNF-induced tight junction regulation in vivo. Journal of Cell Biology. 189 (1), 111-126 (2010).
  10. Yu, D., et al. MLCK-dependent exchange and actin binding region-dependent anchoring of ZO-1 regulate tight junction barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 107 (18), 8237-8241 (2010).
  11. Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. Journal of Experimental Medicine. 203 (13), 2841-2852 (2006).
  12. McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
  13. Edelblum, K. L., et al. Dynamic migration of gammadelta intraepithelial lymphocytes requires occludin. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (18), 7097-7102 (2012).
  14. Edelblum, K. L., et al. gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Migration Limits Transepithelial Pathogen Invasion and Systemic Disease in Mice. Gastroenterology. 148 (7), 1417-1426 (2015).
  15. Hu, M. D., et al. Epithelial IL-15 Is a Critical Regulator of gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Motility within the Intestinal Mucosa. Journal of Immunology. 201 (2), 747-756 (2018).
  16. Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
  17. Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nature Immunology. 7 (9), 995-1003 (2006).
  18. Sandrock, I., et al. Genetic models reveal origin, persistence and non-redundant functions of IL-17-producing gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (12), 3006-3018 (2018).
  19. Wang, X., Sumida, H., Cyster, J. G. GPR18 is required for a normal CD8alphaalpha intestinal intraepithelial lymphocyte compartment. Journal of Experimental Medicine. 211 (12), 2351-2359 (2014).
  20. Sumida, H., et al. GPR55 regulates intraepithelial lymphocyte migration dynamics and susceptibility to intestinal damage. Sci Immunol. 2 (18), (2017).
  21. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), (2011).
  22. Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
  23. Lodolce, J. P., et al. IL-15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation. Immunity. 9 (5), 669-676 (1998).
  24. Ma, L. J., Acero, L. F., Zal, T., Schluns, K. S. Trans-presentation of IL-15 by intestinal epithelial cells drives development of CD8alphaalpha IELs. Journal of Immunology. 183 (2), 1044-1054 (2009).
  25. Knoop, K. A., et al. Antibiotics promote the sampling of luminal antigens and bacteria via colonic goblet cell associated antigen passages. Gut Microbes. 8 (4), 400-411 (2017).
  26. Sujino, T., et al. Tissue adaptation of regulatory and intraepithelial CD4(+) T cells controls gut inflammation. Science. 352 (6293), 1581-1586 (2016).
  27. Zhang, B., et al. Differential Requirements of TCR Signaling in Homeostatic Maintenance and Function of Dendritic Epidermal T Cells. Journal of Immunology. 195 (9), 4282-4291 (2015).
  28. Chennupati, V., et al. Intra- and intercompartmental movement of gammadelta T cells: intestinal intraepithelial and peripheral gammadelta T cells represent exclusive nonoverlapping populations with distinct migration characteristics. Journal of Immunology. 185 (9), 5160-5168 (2010).
  29. Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).

Play Video

Cite This Article
Jia, L., Edelblum, K. L. Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine. J. Vis. Exp. (148), e59853, doi:10.3791/59853 (2019).

View Video