Imagerie intravitale des lymphocytes intraépithéliales dans l'intestin grêle de Murine
Summary
Nous décrivons une méthode pour visualiser gFP-étiquetée IELs utilisant l’imagerie intravitale de l’intestin grêle murine par microscopie confocale de disque de rotation inversée. Cette technique permet le suivi des cellules vivantes dans la muqueuse jusqu’à 4 h et peut être utilisée pour étudier une variété d’interactions intestinales immunisées-épithéliales.
Abstract
Les lymphocytes intraépithéliales exprimant le récepteur des lymphocytes T (IEL) jouent un rôle clé dans la surveillance immunitaire de l’épithélium intestinal. En partie à cause de l’absence d’un ligand définitif pour le récepteur des lymphocytes T, notre compréhension de la régulation de l’activation de l’IEL et de leur fonction in vivo reste limitée. Cela nécessite l’élaboration de stratégies alternatives pour interroger les voies de signalisation impliquées dans la régulation de la fonction IEL et la réactivité de ces cellules au microenvironnement local. Bien que les EI soient largement compris pour limiter la translocation des agents pathogènes, l’utilisation de l’imagerie intravitale a été essentielle pour comprendre la dynamique spatiotemporelle des interactions IEL/épithélial à l’état stable et en réponse aux agents pathogènes invasifs. Ici, nous présentons un protocole pour visualiser le comportement migratoire d’IEL dans la petite muqueuse intestinale d’une souris de journaliste de cellule T de GFP utilisant la microscopie focale focale de laser confocal de disque inversé. Bien que la profondeur maximale d’imagerie de cette approche soit limitée par rapport à l’utilisation de la microscopie à balayage laser à deux photons, la microscopie laser confocale du disque tournant offre l’avantage de l’acquisition d’images à haute vitesse avec un blanchiment de photoet et photodamage. À l’aide d’un logiciel d’analyse d’images 4D, le comportement de surveillance des lymphocytes T et leurs interactions avec les cellules voisines peuvent être analysés à la suite d’une manipulation expérimentale afin de fournir un aperçu supplémentaire de l’activation et de la fonction de l’IEL au sein de la muqueuse intestinale.
Introduction
Les lymphocytes intraépithéliales (IEL) sont situés dans l’épithélium intestinal, et se trouvent à la fois le long de la membrane du sous-sol et entre les cellules épithéliales adjacentes dans l’espace intercellulaire latéral1. Il y a approximativement un IEL pour chaque 5-10 cellules épithéliales ; ces IEL servent de sentinelles pour assurer la surveillance immunitaire de la grande étendue de la barrière épithéliale intestinale2. Les IEL exprimant le récepteur des lymphocytes T (TCR) représentent jusqu’à 60 % de la population totale d’IEL dans l’intestin grêle murine. Des études menées sur des souris déficientes en lymphocytes T démontrent un rôle largement protecteur de ces cellules en réponse à des lésions intestinales, à l’inflammation et à l’infection3,4,5. Malgré la génération de lasouris Kok6 Tcrd , notre compréhension de la biologie IEL reste limitée en partie en raison du fait que les ligands reconnus par le TCR n’ont pas encore été identifiés7. En conséquence, le manque d’outils pour étudier cette population cellulaire a rendu difficile d’étudier le rôle de l’activation et de la fonction de TCR dans des conditions physiologiques et pathologiques. Pour combler cette lacune, nous avons mis au point des techniques d’imagerie en direct pour visualiser le comportement migratoire et les interactions avec les entéroocytes voisins comme un moyen de fournir un aperçu supplémentaire de la fonction ETL et de la réactivité aux stimuli externes in vivo.
Au cours de la dernière décennie, l’imagerie intravitale a considérablement élargi notre compréhension des événements moléculaires impliqués dans de multiples facettes de la biologie intestinale, y compris l’excrétion épithéliale des cellules8, régulation de la fonction de barrière épithéliale9 ,10, échantillonnage de cellules myéloïdes du contenu luminal11,12, et les interactions hôte-microbe11,13,14,15,16 . Dans le contexte de la biologie IEL, l’utilisation de la microscopie intravitale a mis en lumière la dynamique spatiotemporale de la motilité IEL et les facteurs de médiation de leur comportement de surveillance13,14,15, 16. Le développement de souris reporter TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP), qui étiquettes IELs par l’expression gFP nucléaire17, a révélé que les IEL sont très motiles dans l’épithélium et présentent un comportement de surveillance unique qui est sensible aux microbiens infection17,13,14. Récemment, une autre souris de journaliste de cellule T a été développée (Tcrd-GDL) qui exprime GFP dans le cytoplasme pour permettre la visualisation de la cellule entière18. Une méthodologie similaire a été utilisée pour étudier l’exigence de récepteurs spécifiques de chimiokine, tels que les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR)-18 et -55, sur la dynamique de la motilité IEL19,20. En l’absence d’un journaliste spécifique à une cellule, des anticorps conjugués fluorescents contre cD8 ont été utilisés pour visualiser et suivre la motilité IEL in vivo19,20. Bien que la microscopie à balayage laser à deux photons soit couramment utilisée pour l’imagerie intravitale, l’utilisation de la microscopie laser confocale de disque tournant offre des avantages uniques pour capturer des images multicanaux à haute vitesse et à haute résolution avec un bruit de fond minimal. Cette technologie est idéale pour élucider la dynamique spatiotemporelle des interactions immunitaires/épithéliales dans le microenvironnement complexe de la muqueuse intestinale. En outre, grâce à l’utilisation de divers modèles transgéniques et/ou de souris knock-out, ces études peuvent fournir un aperçu de la régulation moléculaire de la fonction immunitaire intestinale et/ou épithéliale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le développement de techniques de microscopie intravitale a fourni une occasion sans précédent d’observer la réorganisation des structures subcellulaires8,9,22, interactions cellule-cellule12, 25 et le comportement migratoire cellulaire13,14,15,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu par NIH R21 AI143892, New Jersey Health Foundation Grant, Busch Biomedical Grant (KLE). Nous remercions Madeleine Hu pour son aide dans l’édition du manuscrit et la fourniture des données présentées dans les résultats représentatifs.
Materials
| 35mm dish, No. 1.5 Coverslip | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Alexa Fluor 633 Hydrazide | Invitrogen | A30634 | |
| BD PrecisionGlide Hypodermic needles – 27g | Thermo Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringe – 1 ml | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Tuberculin Syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-829-9 | |
| Dissecting scissors | Thermo Fisher Scientific | 08-940 | |
| Electrocautery | Thermo Fisher Scientific | 50822501 | |
| Enclosed incubation chamber | OKOLAB | Microscope | |
| Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length | Roboz | RS-7983-3 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | 55037C | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules | Bitplane | Software | |
| Inverted DMi8 | Leica | Microscope | |
| IQ3 (v. 3.6.3) | Andor | Software | |
| Ketamine | Putney | Anesthesia | |
| Kimwipes | VWR | 21905-026 | |
| McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5X0.15mm Straight Sharp | Roboz | RS-5600 | |
| Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided | Fisher Scientific | NC0798934 | |
| Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2mm Tip | Roboz | RS-5228 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | Lubricating Eye Ointment | |
| Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser | Andor | Confocal system | |
| Xylazine | Akorn | Anesthesia |
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